跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测

文章编号 1000-2537（2017）05-0029-07

Fast Construction of Trans-kingdom RNAi Bacteria and Detection of Their Ability to Silence Expression of Target Genes

HU Lin-min1#， YANG Xiao-xu1，2#， WANG Jin1， XIANG Shuang-lin1， WEI Chen-xi1*

（1. The National and Local Joint Engineering Laboratory of Animal Peptide Drug Development，

School of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2. The Medicine School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract Trans-kingdom RNA interference （TkRNAi） is a useful， stable and low-cost approach for small interference RNA delivery， which employs the genetically engineered E.coli to produce short hairpin RNA and then deliver it into mammalian cells. The shRNA， transcribed by the genetically engineered E.coli， can target and silence the particular gene expression in mammalian cells. We used RecA homologous recombination to quickly integrate working components of TkRNAi into the chromosome DNA of engineered E.coli， thus yielding trans-kingdom interference bacteria. Acridine orange staining tests demonstrated that the trans-kingdom interference bacteria could invade into mammalian cells. Finally， western blot analysis results showed that the trans-kingdom interference bacteria could silence expression of target genes. The improvement of the TkRNAi technology will further promote the development and utilization of this kind of engineering bacteria.

Key words siRNA delivery； trans-kingdom RNAi bacteria； RNAi； RecA homologous recombination

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是由小干扰RNA（small interference RNA， siRNA）引起的细胞内序列特异性基因沉默，这给恶性肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望[1].然而，siRNA的低血清稳定性、易脱靶性和易引起免疫反应等缺点，也给临床应用带来了很大的挑战[2].此外，鉴于siRNA自身的结构，导致其不能直接穿过细胞膜，因此找到一种稳定、安全和有效的siRNA传递方式十分重要[3].

“跨界基因沉默”技术利用工程菌携带短发夹RNA（short hairpin RNA， shRNA），将shRNA传递至哺乳动物细胞，引发哺乳动物细胞特定基因的沉默.这种新型siRNA传递技术的出现在某种程度上弥补了RNA干扰药物的传递困境，具有成为临床药物载体的潜力[4-6].“跨界基因沉默”技术由向双林等提出[7]，其基本流程为：首先构建跨界干扰质粒 （Trans-kingdom RNAi plasmid， TRIP） pT7-RNAi-inv-hly.该质粒上的inv基因，其表达产物为Invasin蛋白，能与表皮细胞膜上表达的β1-整合蛋白 （β1-integrin） 结合，促使细胞内陷并吞噬附着于该区域的细菌；hly基因，其表达产物为分泌蛋白LLO，使细菌能够从细胞内体中逃离[8-9].将TRIP转化到大肠杆菌BL21（DE3）（以下简称为BL21（DE3））内，最后将转化TRIP的BL21（DE3）侵染哺乳动物细胞，即可在哺乳动物细胞中发挥RNAi作用[7， 10].然而，质粒转入BL21（DE3）后游离于细菌的胞质中，在无抗性的条件下，质粒容易因环境压力而丢失，不利于质粒稳定存在并表达shRNA.若能使跨界基因沉默技术更加稳定方便，将有利于拓展跨界基因沉默技术的使用范围[11].本研究对跨界基因沉默技术进行改进，将TRIP的工作元件整合到BL21（DE3）的基因组中，改进后的整合型菌株克服了质粒易丢失的缺点，且菌株的保存与使用比质粒更方便.