黄连对糖尿病肾病大鼠肾脏NFκB及PPARγ表达的影响

总结了以“郁、热、虚、损”为特点的糖尿病发病规律，并应用大剂量黄连治疗糖尿病，取得了一定疗效。而在实验研究中也证实了黄连所含盐酸小檗碱、巴马汀等具有一定降低血糖及改善糖尿病并发症的作用[78]。本研究以全成分提取的黄连配方颗粒为干预手段，选取具有肾脏保护作用的PPARγ及促进肾脏炎性反应损伤的NFκB作为观察指标，对比不同剂量黄连配方颗粒对此二者的影响，为临床应用黄连干预DN提供实验依据。

1材料与方法

11材料

111动物清洁级健康雄性SD大鼠70只，体质量160～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）20120001，全部饲养于首都医科大学附属北京世纪坛医院动物实验室（室温20～24 ℃，空气相对湿度50%～70%，昼夜循环12 h，自由进食）。

112药物黄连配方颗粒，基原为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch的干燥根茎，购自北京康仁堂药业有限公司（批号：15005651），1 g黄连配方颗粒提取自10 g黄连饮片；厄贝沙坦片（安博维）购自赛诺菲（杭州）制药有限公司（批号：5A154）；高脂饲料（6675%普通饲料，20%蔗糖，10%猪油，3%蛋黄粉，1%胆固醇，025%胆酸钠）购自北京科澳协力饲料有限公司（批号：11002900017691）。

113试剂与仪器链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司（货号：S0130）；兔抗NFκB p65（A）单克隆抗体（1∶100）购自Santa Cruz公司产品（货号：sc109）；超敏二步法免疫组化检测试剂（货号：PV9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超纯RNA提取试剂盒（货号：CW0581）、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（货号：CW0956）、HiFiMMLV cDNA第一链合成试剂盒（货号：CW0744），均购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。ABI 7500型快速实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司生产。奥林巴斯BX51光学显微镜显微镜为日本奥林巴斯株式会社生产。

12方法

121分组与模型制备SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照组（n=8）和STZ诱导组（n=62），分别予普通饲料及高脂饲料。4周后，STZ诱导组腹腔注射新鲜配制的STZ溶液（35 mg/kg），正常对照组予等剂量的枸橼酸钠腹腔注射。STZ注射72 h及1周后，尾静脉采血测定空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG），2次FBG均超过167 mmol/L者为DM造模成功[9]。造模成功的DM大鼠40只随机分为模型组、厄贝沙坦组、黄连低、中、高剂量组，每组8只。

122给药方法厄贝沙坦组予3125 mg/（kg·d）厄贝沙坦片（安博维）灌胃；黄连低、中、高剂量组分别予52 mg/（kg·d）、3125 mg/（kg·d）、625 mg/（kg·d）黄连配方颗粒剂灌胃[折算为成人黄连饮片用量为：83 mg/（kg·d）、500 mg/（kg·d）、1 000 mg/（kg·d）]，连续给药12周[10]。

123检测指标与方法

1231HE染色第12周末，所有大鼠腹腔注射水合氯醛（10 mg/kg）麻醉，手术剥离大鼠两侧肾脏，将去掉包膜的肾脏纵向剖开，留取包括肾髓质及肾皮质的完整扇形组织。左侧肾脏组织4%多聚甲醛固定、石蜡包埋切片（4 μm），常规HE染色，光学显微镜（×400）观察大鼠肾小球病理改变，使用JEDR 801D形态学图像分析系统软件采集图像。

1232免疫组化染色取石蜡固定切片（4 μm）行免疫组织化学法观察肾小球NFκB表达。步骤：脱蜡；高温高压法组织修复；3%过氧化氢孵育5～10 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加一抗，4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗，2 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，2 min×3次；DAB显色，蒸馏水充分冲洗；DAB显色；苏木素复染细胞核，分化，返蓝；剃度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张切片在高倍镜（×400）下选取含有肾小球的6个连续不重复视野，以胞质或胞核出现金黄色或棕黄色颗粒为阳性信号，采用ImagePro Plus 60图像分析软件测定平均积分光密度值（IOD/area），以平均值作为该大鼠的肾脏阳性产物平均积分光密度值。

1233实时荧光定量PCR检测肾脏PPARγ mRNA表达取右侧肾组织肾皮质100 mg，按超纯RNA提取试剂盒说明书操作进行总RNA提取，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA。采用Primer30及NCBIprimer设计软件设计基因cDNA上游及下游引物，由上海英骏生物技术有限公司合成引物。PPARγ引物序列上游：5′CTCC AGCT GAAG CTGA ACCA3′，下游：5′AGATCTCCTGGAGCAGAGGG3′，163 bp；内参βactin引物序列上游：5′CCCATCTATGAGGGTTACGC3′，下游：5′TTTAATGTCACGCACGATTTC3′，150 bp；待测物相对定量测定采用常用的2-△△Ct法[11]。

13统计学方法使用SPSS 200软件进行数据统计分析，计算资料数据以均數±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用SNK法，方差不齐采用Dunnett′s T3法。以P<005为差异有统计学意义。

2结果

21大鼠肾小球HE染色HE染色可见正常组大鼠肾小球毛细血管球结构清晰，管腔无狭窄，肾小球滤过膜结构完整，未见增厚、皱曲，肾小管结构清晰，肾间质未见炎性反应细胞浸润。DN大鼠肾小球体积缩小、毛细血管球结构破坏，局部肾小球组织纤维化、玻璃样变，毛细血管腔明显狭窄，并有脂质物质沉积导致滤过膜增厚，肾小管萎缩，肾间质血管增生。经厄贝沙坦及黄连低、中、高剂量干预后，大鼠肾小球病变均有改善，肾小球结构尚完整，毛细血管球结构无明显破坏，毛细血管腔狭窄减轻，系膜基质部分增生，HE染色结果见图1。

22大鼠肾脏NFκB免疫组化染色正常组大鼠肾小球可见少量NFκB表达，肾小管中几乎观察不到NFκB着色；与正常组比较，模型组大鼠肾小球着色明显，经西药及黄连各剂量组干预后，NFκB表达减少，结果见图2。平均积分光密度值显示，与正常组比较，模型组、厄贝沙坦组肾小球NFκB表达明显升高，差异有统计学意义（P<005）；与模型组比较，黄连各剂量组NFκB表达明显降低，差异有统计学意义（P<005），其中黄连中剂量组NFκB表达最低，结果见表1。

3讨论

DN的病理改变包括肾小球及肾小管间质肥大、肾小球基底膜增厚、细胞外基质蛋白在肾小球系膜及肾小管间质中的沉积[12]。本研究发现DN模型组肾小球体积缩小、纤维化，功能破坏明显，符合DN后期肾小球纤维化病理改变，经黄连及厄贝沙坦干预后，肾小球纤维化病变减轻，肾脏病理损伤缓解，说明黄连及厄贝沙坦具有缓解DN肾脏损伤的作用。

本研究免疫组化染色观察到模型组NFκB表达集中于肾小球部分，而在肾小管中几乎观察不到NFκB着色，提示在DN进展过程中，由NFκB介导的炎性反应主要发生于肾小球内，其可能通过募集炎性反应细胞向肾小球聚集，诱发炎性反应，导致肾小球损伤。PCR检测发现，模型组肾脏皮质中对NFκB具有抑制作用的PPARγ mRNA含量明显下降，提示在DN发病过程中，促进炎性反应蛋白的增多，和抑制炎性反应蛋白的减少，共同导致了DN肾小球损伤。通过药物干预，发现黄连及厄贝沙坦都能增加PPARγ mRNA的含量，提示二者可能通过PPARγ相关通路抑制了NFκB及其介导的炎性反应，缓解了DN肾脏损伤。此外，黄连干预后，还可直接减少NFκB在肾小球的表达，进一步抑制肾小球炎性反应，这可能由于黄连含有多种有效成分，与厄贝沙坦比较，能多靶点发挥抗炎作用，其具体机制有待深入研究。

总之，本研究发现黄连可减轻DN肾小球损伤，这可能与其抑制DN肾小球NFκB蛋白表达、增强PPARγ mRNA表达相关。

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（2016-11-28收稿责任编辑：王明）