牛磺酸通过p38通路对缺氧内皮细胞ICAM—1，VCAM—1表达的影响

材料与方法

1.1 试剂及仪器 新鲜牛肺取自哈尔滨双城屠宰场，p38，p-p38抗体购于碧云天公司，ICAM-1，VCAM-1，二抗辣根过氧化酶标记羊抗兔和辣根过氧化酶标记羊抗鼠购于Santa Cruz公司。

1.2 原代培养 取新鲜胎牛肺分离肺动脉，至于缓冲盐溶液中（HEPEs，1%青/链霉素），在超净台内纵向剪开血管。使用无菌刀片从血管内表面刮取细胞，然后移入胶原酶溶液（3 mL/血管，盛于35 mm培养皿）。刮取细胞完毕后，将细胞转移至15 mL EP管。25 ℃温育细胞8～9 min后1 500 r·min^-1離心10 min沉淀细胞。弃上清，洗细胞3次。离心细胞弃上清。重悬细胞，培养瓶中48 h后清除非黏附细胞和杂质。

1.3 MTT法检测Tau对PAECs增殖的影响 将0.25%胰蛋白酶置于细胞瓶中消化细胞，10 s后将细胞收集到1个EP管中混匀，均匀接种于96孔板，每孔都加入混匀的细胞悬液200 μL，置于37 ℃，5%CO₂培养箱中孵育。贴壁后，按照：H（不加药），TL（25 mmol·L^-1），TM（50 mmol·L^-1），TH（100 mmol·L^-1）加药缺氧细胞箱孵育12 h。取出96孔培养板，每孔加MTT溶液（5 g·L^-1）20 μL，37 ℃正常细胞培养箱，继续孵育，4 h后，弃上清，再每孔加入150 μL DMSO，酶标仪上振荡10 min，酶标仪测定490 nm处A。

1.4 Western blot 检测ICAM-1，VCAM-及p38通路蛋白表达 收集蛋白以每泳道20 μL蛋白上样，

经120 min电泳后，电转膜至NC膜，分别加入p-p38（1∶1 000），p38（1∶1 000），ICAM-1（1∶400），VCAM-1（1∶400）及β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃封闭过夜后用TBST洗涤，分别摇洗5，15，5，5，5，5 min，分别室温孵育二抗1 h，暗室显影，分析条带。

1.5 Real-time PCR 检测ICAM-1，VCAM-1 mRNA表达 提取RNA，将处理好的肺动脉内皮细胞去除培养液，用PBS洗细胞3次，弃尽PBS后加1 mL TRIzol裂解5 min， 提取细胞总RNA。转移至1.5 mL EP管中，在EP管中加入0.2 mL氯仿。涡旋混匀室温静置15 min。4 ℃，13 500 r·min^-1离心15 min。离心管溶液分3层，吸取最上层溶液400 μL，转移至新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀4 ℃，13 500 r·min^-1离心10 min。小心弃去上清，用现配的75%乙醇溶液（用DEPC水配制）清洗悬浮沉淀，4 ℃，10 600 r·min^-1离心5 min。尽弃上清，晾干管底沉淀，加入ddH₂O 20 μL溶解沉淀。测定RNA浓度及纯度。按照cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应后，取逆转录产物进行PCR扩增反应。引物序列ICAM-1 sense：5′-ACCACAGGAGCAACTTCT-3′，antisense：5′-CGTTCAGGACCACTTCAC-3′，VCAM-1 sense：5′-ACTTCTGGTTGCTCTATTGTG-3′，antisense：5′-CAGTCATCTCAGTGGTAGTG-3′，β-actin sense：5′-TCCGTGACATCAAGGAGAAGC-3′，antisense：5′-GCACCGTGTTGGCGTAGAG-3′。

1.6 免疫荧光检测p38核位移情况 六孔板中加入经灭菌处理后的盖玻片，细胞消化后均匀铺于六孔板中盖玻片上，培养24 h后分组给药结束后，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定15 min后PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，0.5%Triton透化10 min，PBS溶液冲洗3次，每次5 min，3%BSA，37 ℃封闭30 min，PBS冲洗后加入p38一抗（1∶200）4 ℃过夜，第2天回收一抗，PBS冲洗3次，每次5 min，六孔板每孔中的玻片上滴盖100 μL二抗Cy3荧光二抗，37 ℃避光孵育2 h，PBS冲洗3次，每次5 min，每孔加入100 μL DAPI 孵育15 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加抗荧光淬灭剂，封片，置于镜下观察。

1.7 统计学方法 实验数据表示为±s，采用SPSS软件进行分析，进行单因素方差分析和t检验，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度牛磺酸对PAECs增殖的影响 通过MTT法测定细胞活力能够间接反映细胞增殖活力，在缺氧条件下比较各浓度Tau对PAECs增殖的抑制程度，结果显示，缺氧条件下当浓度达到100 mmol·L^-1时Tau可显著抑制PAECs增殖（P<0.01），见图1。

2.2 炎症因子受缺氧刺激表达增加 实验通过Real-time PCR和Western blot法检测缺氧ICAM-1及VCAM-1的mRNA和蛋白水平的表达。结果表明，与空白组对照，缺氧12 h PAECs中ICAM-1及VCAM-1的转录和翻译水平均明显增加，并且，其增加趋势呈时间依赖性。说明随着缺氧时间增加炎症因子也在某种刺激下表达增加，见图2。

2.3 牛磺酸浓度对炎症因子表达影响 根据PCR及免疫蛋白印记法对ICAM-1，VCAM-1蛋白及mRNA水平的检测，缺氧时内皮细胞中炎症因子与常氧比显著增加，Tau对炎症因子的抑制能力随着Tau浓度增加而增强，说明缺氧诱导的黏附因子表达被Tau所抑制，当浓度达到100 mmol·L^-1时抑制作用最强，见图3。

2.4 Tau对炎症因子表达的影响 体外培养内皮细胞，使用Western blot和Real-time PCR检测炎症因子蛋白和mRNA的表达。缺氧加p38通路抑制剂SB203580处理后及给予100 mmol·L^-1 Tau炎症因子表达均有降低，并且在用抑制剂处理后再加入Tau后炎症因子表达更低，表明Tau可能通过p38通路抑制炎症因子表达，并且与p38通路抑制剂有协同作用，见图4。

2.5 Tau对p38通路的影响 根据Western blot检测p38，p-p38蛋白的表达，缺氧加p38通路抑制剂SB203580处理后及给予100 mmol·L^-1 Tau炎症因子表达均有降低，并且在用抑制剂处理后再加入Tau后p-p38蛋白表达更低，表明Tau可能有抑制p38通路的作用，并且与p38通路抑制剂有协同作用。免疫荧光结果显示常氧及缺氧给药后与缺氧培养的内皮细胞相比呈核空染状态，说明Tau具有抑制p38通路激活的作用，见图5。

3 结论

从MTT结果可以看出，Tau能显著抑制由缺氧引起的内皮细胞增殖，并且具有剂量依赖性，随着Tau的浓度增加，内皮细胞的抑制效果越明显。根据此结果，本试验认为在缺氧条件下Tau能有效抑制内皮细胞增殖，最佳给药浓度为100 mmol·L^-1。

本实验发现随着缺氧时间增加，炎症因子表达逐渐增加，姑且推断缺氧可以刺激内皮细胞表达ICAM-1，VCAM-1，而在炎症因子表达高峰时给予不同浓度Tau时，炎症因子会随着给药浓度增加而降低，在缺氧12 h给药浓度为100 mmol·L^-1时效果最佳。目前认为在血管内由于内皮功能受损或氧化应激等因素都可以导致炎症反应的发生，炎症反应又可以引起其他病变，因为ICAM-1，VCAM-1是反映局部和全身炎症的主要炎症标志物，所以通过观察ICAM-1和VCAM-1水平的变化本实验认为Tau可能具有抑制缺氧引起的炎症的功能。

Western blot和免疫荧光的结果显示，Tau能有效抑制p38通路的激活，明显一直降低p-p38的表达。本实验推断Tau可能通过抑制p38通路的激活以降低内皮细胞黏附因子的表达从而达到抗炎作用。

虽然肺动脉高压成因复杂，现在尚未完全研究透彻其致病机制，但其发生发展始终伴随炎症过程[5]，炎症因子在炎症细胞募集、炎症的维持及进展方面有重要作用[6]，肺动脉高压炎症作为PAH早期诊断标准也逐渐被认可。并且其血管内皮细胞受损时会引发肺血管重构等相关病变，这也是肺动脉高压初始的重要特征，并且是肺动脉高压的基本病理特征[7]。p38 MAPK则是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员，参与细胞的生长、分化、应激反应、炎症反应等多种生理及病理过程[8-9]。p38 MAPK主要通过被 MKK3，4，6磷酸化后发生激活，进而磷酸化下游的通路蛋白[10-11]。 因此，检测p38 MAPK可以反映该通路的活化状态。所以，通过p38通路抑制肺动脉炎症的发展进而达到逆转肺动脉内皮层增殖，将很可能成为治疗肺动脉高压新的关键入手点。ICAM-1，VCAM-1的表达一方面内皮细胞增殖密切相关，另一方面，其也是炎症反应的标志蛋白，其表达的增高将可能成为肺动脉高压炎症早期诊断的标志物和治疗的关键。抗炎治疗将成为一条治疗肺动脉高压新的途径，从稳定内皮功能、减少炎症细胞浸润，抑制肺血管炎症，达到抑制血管增生、减轻血管重构的目的。

通過实验，可以发现Tau抑制p38通路的激活，这可能是Tau抗炎作用的一个方面。因此本实验认为，p38通路在肺动脉高压中发挥了一定的作用，Tau或可能通过其抗炎作用抑制内皮细胞增殖来缓解肺动脉高压，但其长期作用还有待进一步观察。

[参考文献]

[1] 张晓丹， 孙鹏， 朱大岭， 等.牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及信号转导机制[J].中国中药杂志， 2014， 39（10）： 1902.

[2] Liao X B， Zhou X X， Li Jin， et al. Taurine iinhibits osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle sell via the ERK pathway[J]. Amino Acid， 2008， 34（8）： 525.

[3] Ono K， Han J H. The p38 dingal transduction pathway actination snd function[J]. Cell Singal， 2000， 12（1）：1.

[4] Kotteas E A， Boulas P， Gkiozos l， et al. The intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1） in lung cancer： implications or diswase progression snd prognosis[J]. Anticancer Res，2014， 34（9）：4665.

[5] Price L C， Wort S J， Perros F， et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension [J]. Chest， 2012， 141（1）： 210.

[6] Charo I F， Ransohoff R M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation[J]. N Engl J Med， 2010， 354（6）： 610.

[7] Dhala A. Pulmonary arterial hypertension in systemic lupuserthematesus： current status andfuture diredtion[J]. Clin Dev Immunol， 2012， 10： 12.

[8] Uadrado A， Nebreda A R.Mechanisms and functions of p38 MAPK siginalling [J]. Biochem J，2010， 419（3）： 403.

[9] Sanz A B，Sanchez-Nino M D. NF-kappaB in renal imflammation[J]. J Am Soc Nephrol， 2010， 21（8）： 1254.

[10] Vegliance P， Lo Coco， Bao Cutrona， et al. Activation of the p38 MAPK cascade is associated with upregulation of TNF alpha receptors in the soinal motor neurors of models of familial ALS[J]. Mol Cell Neurosci， 2006， 31（2）： 218.

[11] Liu X， Ye F， Xiong H， et al.TL-1 beta induces IL-6 production in retinal Nuller cells predominatly through the activation of p38 MAPK/NF-kappaB sojnaling pathway [J]. Exp Cell Res， 2015， 331（1）： 223.

[责任编辑 张宁宁]