中药淫羊藿苷对TDP43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物细胞培养 购自美国Sciencell公司的人软骨细胞，并采用美国Life公司生产的DMEM高糖培养基予以培养，其中培养基包含100 mg/mL青霉素（购自基诺生物医药技术有限公司）、10%胎牛血清（购自美国Hyclone公司）以及100 mg/mL链霉素。待人软骨细胞生长融合至80% ～90%后，采用0.25%的胰酶（购自基诺生物医药技术有限公司）予以处理，胎牛血清终止后离心除去胰酶予以扩增培养。本实验研究经伦理委员会审批（伦理审批号：20180623）

1.1.2 中药淫羊藿苷的制备 取10 mg的淫羊藿苷粉末（购自陕西西安飞达生物技术有限公司，生产批号：FD20110415）加入1 mL二甲亚砜（DMSO）中，混匀后继续加入10 mL的细胞生长稀释液，再次混匀后吸取10 μL的上述液体加入至10 mL的细胞营养液中，得到浓度为1 μg/mL的中药淫羊藿苷药液，以0.22 μm无菌滤器过滤除菌，放置于4 ℃条件下保存待用。

1.1.3 试剂与仪器 1）Trizol试剂盒（上海名劲生物科技有限公司，货号：5003050）;2）PCR仪（购自赛默飞公司的GeneAmp 9700型）;3）二氧化碳培养箱（上海跃进医疗器械有限公司，型号：HYQX-Ⅲ）;4）台式离心机（上海精密仪器仪表有限公司，型号：E33型）。5）PI（购自上海碧云天生物技术有限公司）;6）流式细胞仪（购自美国贝克曼库尔特公司，型号：DxFLEX型）;7）细胞计数仪（购自美国Invitrogen公司，型号：Countess）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）TDP-43表达载体与慢病毒包装：采用Trizol试剂盒提取人外周血单个核细胞的总RNA，并通过逆转录获取cDNA，随后以PCR扩增技术获取野生型的TDP-43目的基因，引物序列如下：正义链：5，-GAGGATCCCCGGGTACCGGT-CGCCACCATGTCTGAATATATTCGGGTAAC-3。反义链：5，-TCCTTGTAGTCCATACC-CATTCCCCAGCGAGAAGACTTAG-3。PCR反应条件如下：95 ℃10 min预变性，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环，72 ℃10 min。将上述扩增完成的片段经由胶回收处理，以AgeI/AgeI分别双酶切Lv-GV358-GFP。采用T4DNA连接酶促进TDP-43目的基因PCR產物和酶切线性的质粒之间的连接反应，待重组载体形成后，转化DH5α感受态细菌，通过菌液PCR检查阳性克隆后，予以酶切鉴定处理，并移送相关公司进行测序。于6孔板上铺293T细胞，促使其24 h汇合率达至70%，将制备获取的三质粒DNA溶液加入含有250 μL DMEM的培养基中。此外，取10 miul脂质体Lipofectamine 2000与250 μL DMEM的培养基混合，放置于室温条件下碱性5 min的孵育。随后将上述2种溶液混合，放置于室温条件下进行20 min的孵育，将其加入至293T细胞中，并放置于37 ℃，二氧化碳浓度为5%的培养箱中培养6 h。然后更换新的培养液，再次放置在上述条件的培养箱中培养48 h。采集上清病毒液，采用荧光法测定所获取的TDP-43-Lv-GV358病毒液的病毒滴度。2）TDP-43慢病毒转染人软骨细胞：将人软骨细胞接种于6孔板中，每孔细胞数为3×105，体系为3 mL，首先于DMEM/高糖中培养过夜，随后加入不同MOI值的慢病毒，混匀培养8～12 h后更换新鲜培养基，放置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，以显微镜明确GFP荧光强度以及最佳转转染MOI值。以最佳转染MOI值进行慢病毒转染，获取转染TDP-43慢病毒与空载体GV358慢病毒的人软骨细胞，分别为30例与28例。见图1。

1.2.2 干预方法 1）荧光定量PCR检测：所有人软骨细胞培养7 d后采用Trizol提取总RNA，并通过逆转录获取cDNA，反应体系为20 μL，包括20～50 ng的cDNA，0.2 μmol/L各引物以及10 μLGoTaq qPCR Master mix。反应条件为95 ℃2 min，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40个循环。采用Mx3005PTM Detection Systenm仪器进行检测。其中TDP-43引物如下，正义链：5，-CGGCTAGCGGGAAAAGTAA-3，反义链：5，-GAGCCGGACACCTCTCATAC-3，;Ⅰ型胶原α1引物如下，正义链：5，-GGCAACCT-CAAGAAGTCCC-3，反义链：5，-GTGCAGCCATCCACAAGC-3。目的基因每个样本重复检测3次，以2-△△Ct进行表示。2）中药淫羊藿苷干预：取TDP-43慢病毒转染完成的人软骨细胞至6孔板中，放置于DMEM/高糖中培养。将其随机分成3组，分别加入不同浓度的淫羊藿苷进行干预，其中低浓度组、中浓度组、高浓度组加入淫羊藿苷浓度分别为10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL。

1.2.3 检测指标与方法 比较3组人软骨细胞中靶基因TDP-43与Ⅰ型胶原蛋白α1表达情况，TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞加入中药淫羊藿苷前后细胞凋亡情况，加入不同浓度中药淫羊藿苷培养后的软骨细胞计数水平。其中细胞凋亡情况的检测：人软骨细胞分别在培养9 d后进行细胞凋亡的检测分析：取2×105人软骨细胞采用PBS重复洗涤2次，重悬于100 μL结合缓冲液中，加入5 μL的Annexin V-FITC与5 μL的PI，混匀后于室温条件下染色15 min，随后直接采用流式细胞仪进行检测。软骨细胞增殖分析：对软骨细胞进行培养后，于显微镜下观察其形态所发生的改变。并于共培养前后采用胰酶消化，予以台酚蓝染色，采用细胞计数仪进行检测，每次重复检测3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件予以数据分析，计数资料以百分率表示，进行χ2检验。计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行t检验。多组间的计量资料比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组人软骨细胞中靶基因TDP-43与Ⅰ型胶原蛋白α1表达比较 TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞中TDP-43基因表达水平相比正常人软骨细胞、空白慢病毒转染的人软骨细胞较高，差异有统计学意义（P<0.05）;而3组Ⅰ型胶原蛋白α1基因表达水平相比均不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞加入中药淫羊藿苷前后细胞凋亡比较 加入不同浓度的中药淫羊藿苷后TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞凋亡率相比加入中药淫羊藿苷前均较低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 加入不同浓度中药淫羊藿苷培养后的软骨细胞计数比较 培养3 d后、6 d后、12 d后高浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数水平比中浓度高，而中浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数水平比低浓度高，3组差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

随着近年来我国人口老龄化问题的日益加重，骨关节炎的发病率正呈逐年升高趋势，已成为严重影响老年人膝关节以及髋关节慢性疼痛、残废的重要原因[5-6]。该病患者随着病程的逐渐延长，可能会出现患肢关节肿胀、疼痛、无法站立等临床症状，病情严重者甚至会死亡，给社会、经济的发展造成了极大的影响[7-8]。TDP-43是普遍存在于人体的一种核蛋白，属于1型TAR DNA元件的结合蛋白。药物诱导细胞应急时会促使TDP-43于细胞质中累积，参与了囊性纤维化跨膜转导调节因子存活与运动神经元RNA剪接的调控过程。TDP-43在骨性关节炎炎性反应导致的细胞应激中，可能具有一定的调节作用，促进软骨细胞凋亡[9-10]。迄今为止，临床上关于TDP-43在骨性关节炎中的表达是否促进软骨细胞病变的相关报道并不多见。中医认为，骨关节炎属于“骨痹”“痹症”等范畴，其主要病因为肾精亏虚，肾虚血瘀贯穿整个病理过程。因此，临床中医治疗骨关节炎主要以补肾活血为主[11-12]。中医学认为，肾主骨，肾藏精，精生髓，髓养骨，骨生髓，因此补肾之法可治關节软骨病变以及骨质疏松等[13-14]。淫羊藿苷对骨科疾病具有一定的调节作用，其可通过促进钙、磷等物质在骨中的沉积增加骨密度，同时可产生类似于雌激素的抗骨质疏松作用，且有效规避了雌激素的弊端。研究报道表明，淫羊藿苷可通过不同的作用机制，对不同的基因以及细胞因子产生一定影响，促进成骨细胞的增殖以及分化[15-18]。目前，临床上关于淫羊藿苷对于TDP-43基因的作用机制的相关研究较为少见。由此，我们通过研究分析中药淫羊藿苷对TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制，目的在于明确淫羊藿苷对TDP-43介导的骨关节炎软骨细胞病变的作用机制，为临床治疗骨关节炎提供新的靶点和思路。

本研究结果表明，TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞中TDP-43基因表达水平比正常人软骨细胞、空白慢病毒转染的人软骨细胞高;而3组Ⅰ型胶原蛋白α1基因表达水平比较，差异不明显。这提示了TDP-43基因转染人软骨细胞并不会对软骨细胞特性产生较大影响。此外，加入不同浓度的中药淫羊藿苷后TDP-43慢病毒转染的人软骨细胞凋亡率比加入中药淫羊藿苷前低，差异有统计学意义。提示了TDP-43慢病毒转染可能会增加人软骨细胞的凋亡率。分析原因，可能与TDP-43在骨性关节炎所引起的炎性反应以及细胞应激过程中发挥负面的调控作用有关。其中TDP-43促进软骨细胞凋亡的具体分子机制可能与细胞应对不同应激反应，快速形成应激颗粒有关。虽然目前体内促使TDP-43形成应急颗粒的具体应急因素尚未完全明确，但在部分细胞培养体系中，包括热休克、渗透应激以及内质网应激等因素均能导致TDP-43阳性的应激颗粒形成。而淫羊藿苷可能是通过调控TDP-43的相关信号转导通路，抑制TDP-43的表达，促进了骨细胞的增殖以和分化，并可在骨组织中发挥作用，促进骨形成以及成骨细胞的生长，最终达到降低人软骨细胞凋亡率的目的[19-20]。而随着淫羊藿苷浓度的增加，其药效也随之增强，因此其抑制软骨细胞凋亡的作用也更加明显。另外，培养3 d后、6 d后、12 d后高浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数水平比中浓度高，而中浓度中药淫羊藿苷培养的软骨细胞计数水平比低浓度高，3组间差异有统计学意义。这提示了淫羊藿苷有利于提高软骨细胞计数，且存在剂量依赖效应。究其原因，可认为淫羊藿苷是通过激活P38以及ERK1/2通路，从而促使细胞G1期阻滞，P38通路的激活可对细胞周期的阻滞产生调节作用，而ERK1/2通路不仅在细胞周期中发挥着正调节作用，同时可诱导G1期阻滞起调节作用[21-23]。因此，淫羊藿苷有利于关节软骨细胞的增殖，且随着其浓度的增加，效果更加明显。

综上所述，中药淫羊藿苷可能通过改善TDP-43在骨关节炎软骨细胞病变过程中的负调控作用，从而有利于调节软骨细胞增殖，促进软骨细胞病变的恢复。

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（2018-08-17收稿 责任编辑：杨觉雄）