PMA—LAMP法对克氏螯虾样品中沙门氏菌的快速检测

摘要：采用环介导等温扩增技术（PMA-LAMP）对克氏螯虾（Cambarus Clarkii）样品中沙门氏菌进行快速检测，旨在建立一种快速简便、灵敏度高、特异性强的检验方法。分别采用PMA-LAMP、PCR检测方法对沙门氏菌进行检测。结果表明，PMA-LAMP法检测限为2×10 CFU/mL，PCR法和GB/T 4789.4-2008检测限为2×103 CFU/mL。采集湖北省省内60份市售的克氏螯虾样品，分别采用PMA-LAMP检测方法、PCR检测方法及国家标准方法（GB/T 4789.4-2008）对样品进行检测，PMA-LAMP 方法检出6例沙门氏菌，阳性率为10%；PCR检测方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%；国家标准方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%。

关键词：PMA-LAMP法；沙门氏菌（Salmonella）；克氏螯虾（Cambarus Clarkii）

中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5854-04

湖北省是小龙虾（克氏螯虾，Cambarus clarkii）养殖大省，小龙虾养殖业快速发展的同时也引发了食源性病原微生物污染的食品安全问题。2010年7月份以来，南京陆续收治因食用克氏螯虾而入院的病人，经检查诊断为横纹肌溶解综合征（哈夫病）。螯虾体内的药物残留、重金属及携带的病原微生物都可能成为哈夫病的致病因素。克氏螯虾养殖主要分布于低湖田、水稻田、池塘、沟渠等地区，受生长环境的影响，克氏螯虾体内可能寄生多种病原微生物，在养殖、运输、销售等诸多环节均有可能产生安全隐患，但是这些过程食品安全隐患很难被发现，只有进入餐饮环节后，安全问题才得以突显。因此在小龙虾养殖业中建立快速监测病原微生物的方法及制定标准化的养殖体系迫在眉睫。

沙门氏菌（salmonella）是最常见的食源性病原微生物，可引起人畜胃肠炎、伤寒和副伤寒等症[1，2]。人畜感染后可呈无症带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。传统的沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂等缺点已不能满足现代检测要求，因此研究沙门氏菌快速、有效的检测方法显得尤其重要[3-5]。常规检测采用传统培养方法，致病菌需要独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员的专业、经验等多种因素限制，容易出现误判[6，7]。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。聚合酶链式反应（PCR）技术不断应用于病原微生物的快速检测。但PCR技术在现场快速检测适用性上具有一定的局限性。环介导等温扩增技术（PMA-LAMP）由Nagamine等[8]于2000年建立，该技术通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下（60～65 ℃）高效扩增目标DNA。该方法具有检测快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、适用于现场检测。与PCR反应相比，PMA-LAMP反应最明显的优势是不需要高精密的仪器设备，同时检测灵敏度和特异性又能满足快速鉴定病原微生物的需要[6]。

1 材料与方法

1.1 标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562均购自广东省微生物研究所。

1.2 试剂及培养基

食品中沙门氏菌PMA-LAMP快速检测试剂盒（湖北泰扬生物工程有限公司）；叠氮溴化丙锭（Biotium公司）；DNA Marker、Taq酶购于北京天根生物有限公司；二甲亚砜（Sigma公司）；缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、四硫磺酸盐煌绿增菌液、亚硫酸铋琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、营养肉汤和营养琼脂均购自北京陆桥技术有限公司。

1.3 仪器

电热恒温水浴锅（金坛新航仪器有限公司）；S1000型PCR扩增仪、Gel Doc EQ凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；高速离心机（Sigma公司）；电泳仪（北京六一厂）；全自动高压灭菌锅（日本三洋公司）。

1.4 样品的制备和选择性增菌

依据 GB/T4789.4-2008《食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法进行样品制备和选择性增菌。

1.4.1 国家标准方法 依据GB/T 4789.4-2008《食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行菌株的分离和生化鉴定试验。

1.4.2 PCR检测方法 根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因序列，应用Primer 5设计特异性引物。上游引物为GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG

CAA；下游引物为TCATCGCACCGTCAAAGGAACC。

20 μL的扩增体系包括：2 μL反应液，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL （0.2 μmol/L），2 μL dNTP mixture，1 μL Taq酶，1 μL 25 mmol/L MgSO4，11 μL去离子水。PCR 反应体系：94 ℃预变性5 min，30个循环，每个循环94 ℃（30 s）、56 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）， 72 ℃（10 min）。扩增产物在2 %琼脂糖凝胶上100 V电泳分离60 min，加样量为5 μL/上样孔。

1.4.3 叠氮溴化丙锭处理 用20%二甲基亚砜配制40 mmol/L的PMA溶液，-20 ℃避光保存。将PMA（40 mmol/L）依次加入装有0.5 mL沙门氏菌活菌菌悬液离心管中，充分混匀后，将离心管于暗室中放置15 min。然后将离心管开盖放置冰上，距卤钨灯（500 W）约15 cm，曝光时间为5 min。

1.4.4 沙门氏菌DNA模板制备 将过夜培养的沙门氏菌菌悬液（2×109 CFU/mL）置于离心管中，依次稀释为2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL的菌悬液，经过叠氮溴化丙锭处理后，在100 ℃沸水中煮沸5 min，8 000 r/min离心2 min，取上清液作为DNA模板备用。

1.4.5 PMA-LAMP检测方法 根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因序列，应用Primer Explorer 4设计特异引物。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。PMA-LAMP反应体系（25 μL）如下：依次加入10×Thermopol反应缓冲液2.5 μL，Bst聚合酶1 μL，引物，dNTP，模板和去离子水。引物FIP和BIP终浓度为1.8 μmol/L；引物F3和B3终浓度为0.2 μmol/L；引物LF和LB终浓度为1.0 μmol/L。在62 ℃水浴中反应60 min，在85℃水浴中温浴5 min使酶失活。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上120 V电泳分离60 min，加样量为5 μL/上样孔。

1.5 PMA-LAMP检测方法的特异性

分别将4株沙门氏菌和其他5株非沙门氏菌（依次为大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562）接种到增菌培养基上，于（36±1） ℃，300 r/min 摇床培养16 h，离心后将菌体依次用无菌生理盐水稀释至2×104 CFU/mL菌悬液，按照“1.4.5”的方法进行检测。

1.6 人工污染食品中沙门氏菌检测

1.6.1 不同浓度菌液的制备 挑取沙门氏菌标准菌株ATCC14028至营养肉汤中增菌，于（36±1） ℃，300 r/min 摇床培养16～18 h，用生理盐水制成菌悬液，依次再用无菌生理盐水10倍梯度稀释至2×107、2×106、2×105、2×104 CFU/mL。

1.6.2 人工污染样的制备 将检测无沙门氏菌污染的克氏螯虾样品按GB/T 4789.4-2008方法制成1∶10 稀释液。吸取制备好的 2×106、2×105、2×104、2×103 CFU/mL菌悬液依次加入每组1∶10 稀释液中，混匀，菌悬液浓度依次为2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培养12～16 h后分别按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌PCR和PMA-LAMP检测方法检测结果

将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028按照2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL依次稀释，通过煮沸法提取鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 DNA，将其用于PMA-LAMP反应和PCR反应，当反应体系中存在鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 DNA时，PMA-LAMP检测方法扩增反应会产生大量的、大小不等的DNA重复序列，凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，PCR检测鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的检出限为2×103 CFU/mL，而PMA-LAMP检测鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的检出限为2×10 CFU/mL。

2.2 PMA-LAMP检测方法的特异性

4株沙门氏菌均呈阳性反应，其他5株非沙门氏菌（为大肠埃希氏菌ATCC25922、福氏志贺菌CMCC6120513、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、创伤弧菌ATCC27562均为阴性（图2）。由图2可知，按照方法“1.4.3”的扩增体系，62 ℃温育45 min，4株沙门氏菌在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带，5株非沙门氏菌均为阴性，去离子水作为阴性对照，通过琼脂糖凝胶电泳无扩增条带。

2.3 人工污染克氏螯虾样品中沙门氏菌检测结果

将检测无沙门氏菌污染的克氏螯虾样品按GB/T 4789.4-2008方法制备样品，菌悬液浓度依次为2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培养18～24 h后分别按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法进行检测（表2）。由表2可知，国家标准方法与PMA-LAMP检测方法的检测结果一致。PCR检测方法的最低检出限高于国家标准方法和PMA-LAMP检测方法。

2.4 克氏螯虾样品的检测结果

采集60份市售的克氏螯虾样品，PMA-LAMP 检测方法检出6例沙门氏菌，阳性率为10%；PCR检测方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%；国家标准方法检出4例沙门氏菌，阳性率为6.7%。PMA-LAMP检测方法与国家标准方法的阳性率差异不显著性，并且比国家标准方法的检出限低。

3 结论

湖北省是水产养殖大省，近年来湖北省大力发展克氏螯虾养殖，其年平均产值达20亿元以上。克氏螯虾养殖主要集中在水稻田、池塘、沟渠等地，受养殖环境的影响，克氏螯虾体内可能会寄生多种病原微生物，由此容易引发食源性病原微生物问题。因此在养殖环节建立食源性病原微生物监测体系，对食源性病原微生物做到早检测早预防。目前LAMP技术已被应用于食源性病原微生物的快速检测，与传统的快速检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法具有检测快速、操作简便、灵敏度高、特异性强、成本较低、不需要精密仪器的优点，特别适合现场快速检测的需求。本研究建立了快速检测克氏螯虾沙门氏菌PMA-LAMP检测技术，应用PMA-LAMP检测方法检测克氏螯虾样品中沙门氏菌，与国家标准检测方法比对，两种方法检测结果相同，可为食品安全快速检测提供一种新的思路，PMA-LAMP检测方法具有快速、灵敏度高、操作简便等优点，并能检测鉴定沙门氏菌病原活细胞[6，9]。

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