二氢卟吩载药胶团的制备及体外光动力效应研究

摘要 [目的]研究二氢卟吩e6（Ce6）载药胶团的体外光动力疗法（PDT）对子宫颈癌Hela细胞的杀伤作用。[方法]合成壳聚糖硬脂酸聚合物二氢卟吩e6载药胶团（CSO-SA/Ce6）和叶酸修饰聚合物的二氢卟吩e6载药胶团（FA-CSO-SA/Ce6）后，通过荧光显微镜观察载药胶团对细胞的毒性。以游离的Ce6、壳聚糖硬脂酸聚合物（CSO-SA）为对照组，应用MTT法检测Ce6载药胶团对Hela细胞的毒性作用；同时采用波长630 nm的半导体激光垂直照射到24孔培养板上，照射时间为180 s/孔，继续孵育细胞24 h，应用MTT法检测载药胶团在光照条件下对Hela细胞的光动力杀伤效率。[结果]荧光显微镜显示，Ce6载药胶团不影响细胞的数量和形态，对Hela细胞毒性较小；MTT法表明，Ce6包载后，对Hela细胞的PDT杀伤作用显著强于Ce6。[结论]Ce6载药胶团对Hela细胞具有良好的光动力杀伤作用，且PDT杀伤效率优于Ce6。

关键词 二氢卟吩 e6；载药体系；光动力疗法；制备

中图分类号 S859 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05034-03

光动力学治疗 （photodynamict therapy，PDT） 是20世纪80年代初兴起并在近年迅速发展的新颖治疗肿瘤的方法，在临床上得到了广泛的应用。光动力学疗法具有毒性小、收效快、靶向性强的特点，在杀伤增殖细胞的同时不危及正常组织[1-2]。通过生物光动力敏化作用，即在特定波长的激光照射后，光敏剂受到激发，由基态（S0）经激发单线态（S1）转变为激发三线态（T1），然后由激发三线态（T1）使周围介质中的分子氧成为单线态氧（1O2）等活性物质，它们与生物分子中的氧化敏感基团作用，导致其氧化失活，最终引起肿瘤细胞死亡而显示其治疗作用[3]。目前临床上应用的光动力治癌药物如血卟啉衍生物（HpD）、光敏素Ⅱ等均为成分复杂的卟啉混合制剂，存在着在红光区的吸收系数小、有效光动力效应低、光毒反应大及化学组成不定等缺点。而二氢卟吩 e6（Ce6） 是叶绿素稳定降解产物中与生物活性联系最广的成分之一，且已成为光动力治癌新药研究中倍受瞩目的研究对象。有报道表明，Ce6 具有两亲性能（亲水性和亲脂性），能产生良好的肿瘤/正常组织比率，且吸收波长移到了红光区（664 nm），单线态氧产率Ф△较高，对肿瘤的抑制率远好于HpD[4]。近年来，为了提高光敏剂在肿瘤细胞的浓度，许多研究组将第二代光敏剂负载在适当的载体上，制成脂质体、纳米粒、乳剂等，通过正常生理过程选择性地运送、积集至靶组织，大幅度提高光敏剂抗肿瘤活性，这对提高药物治疗作用、降低毒副作用具有十分重要的意义。Richter 等研究发现苯并卟啉衍生物单环酸A制成脂质体，能介导药物迅速地进入组织[5]。Vargas 等将 meso-（对羟基苯）卜啉（p-THPP）制成 PLGA 纳米粒，可明显增强药物对乳腺癌细胞的作用[6]。

壳聚糖是一种具有低毒、高生物相容性、可体内降解的阳离子型载体材料。但小分子量的壳聚糖即壳寡糖（chitosan oligosaccharide， CSO），本身缺乏亲脂性，不易被细胞摄取即较难透过细胞膜；考虑到生物膜主要为脂质屏障，以脂溶性材料为主要组成成分的固体脂质纳米粒，具备较强的细胞膜穿透能力。为此，设想将亲水性多糖入核与脂溶性纳米粒入膜的机理进行组合设计，利用壳寡糖的氨基与硬脂酸的羧基进行化学嫁接，形成阳离子嫁接物，该嫁接物在水性介质中形成内部疏水、外部含亲水性多糖分子的阳离子嫁接物胶团。该试验以碳二亚胺为交联偶合剂对水溶性的低分子量壳聚糖进行疏水性改造，制备得壳聚糖硬脂酸聚合物，将该聚合物分散于水中，可通过自聚集形成聚合物胶团；以 Hela 细胞系为模型细胞，对壳聚糖硬脂酸聚合物载药胶团进行细胞光动力效应研究，考察 Ce6 在被壳聚糖硬脂酸聚合物包载前后的体外光动力效应变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂。碳二亚胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide， EDC， 美国Sigma 公司）、壳聚糖硬脂酸聚合物（stearic acid grafted chitosan oligosaccharide，CSO-SA，自制，氨基取代度为3.48%）、叶酸（folic acid， FA，美国Sigma 公司）、细胞培养基1640（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号08062502）、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号080614）、四唑蓝（3-（4，5-dimethyl-thiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide， MTT， 美国Sigma 公司，批号090318）、二氢卟吩 e6（chlorin e6， Ce6， 上海红绿光敏剂有限公司，批号20080324），其他溶剂和试剂均为分析纯。

1.1.2 细胞。子宫颈癌细胞（Heietta Lacks，Hela，中科院上海细胞所）。

1.1.3 仪器。Millipore 超滤离心管（MWCO 10，000，USA）、Thermo 3110 型二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma公司）、Olympus 71-22型荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）、JD-1 型氦氖激光电源（南京来创激光科技有限公司）、USC-302 型超声波清洗器（上海船舶电子设备厂）、85-2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）、BS 110S型电子天平（上海天平仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 叶酸修饰壳聚糖硬脂酸聚合物的合成。采用碳二亚胺法[7]对CSO-SA进行叶酸修饰。精密称取CSO-SA 200 mg和叶酸（folic acid， FA）2.0 mg，加入100 ml蒸馏水探头超声使溶解，然后加入EDC 20 mg，维持90 °C水浴加热， 搅拌5 h后停止加热，待反应产物冷却至室温后将其置于透析袋中（MWCO 3.5 KDa， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）透析48 h，以除去水溶性的小分子副产物，将透析液冷冻干燥，即得叶酸修饰的壳聚糖-硬脂酸聚合物（FA modified CSO-SA micelles， FA-CSO-SA）。

1.2.2 Ce6载药胶团制备。取一定量的 Ce6 醇溶液，与等体积的 CSO-SA 分散液混合，探头超声 20 次，制备载药胶团，用透析袋封装溶液，在 500 ml 水溶液中于室温下透析 24 h 除去乙醇，透析保留液即为 Ce6 载药胶团，冻干备用。

1.2.3 叶酸修饰聚合物的二氢卟吩e6载药胶团的制备。称取叶酸修饰聚合物 FA-CSO-SA 10 mg，配制成5.0 g/L的FA-CSO-SA 水溶液，同时配制 0.5 g/L的Ce6 醇溶液。两溶液等体积混合，冰浴探头超声20次，转移至透析袋中，用去离子水于室温下透析 24 h 除去乙醇。透析保留液即为 Ce6载药胶团（chlorin e6 loaded FA-CSO-SA micelles， FA-CSO-SA/Ce6），冻干备用。

1.2.4 细胞培养。取子宫颈癌细胞Hela在含有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）的 1640 培养液中连续培养（5% CO2， 37 ℃孵箱）。用常规的胰酶/EDTA消化传代。

1.2.5 载药胶团的细胞毒性。

1.2.5.1 载药胶团对细胞毒性的荧光显微镜观察。将 Hela 细胞按 1.0 ×105个/（ml · 孔）接种于24孔培养板，置37 ℃，5%CO2 孵箱培养 24 h，待细胞完全贴壁后，加入 CSO-SA/Ce6，以未处理的空白细胞为对照，每孔设 3 个复孔。将培养板直接置于荧光倒置显微镜下，定时观察细胞形态并拍照。

1.2.5.2 载药胶团对细胞毒性作用。采用四唑蓝比色法[8]（MTT Assay）进行细胞毒性研究。取对数生长期的 Hela 细胞，经胰蛋白酶消化后，用含 10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的 1640 培养基调整细胞密度为 1.0 ×105个/（ml·孔），接种于24孔培养板，每孔 1.0 ml，置 37 ℃，5%CO2 孵箱培养 24 h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的 CSO-SA、Ce6 和 CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，以未处理的空白细胞为对照，每孔设 3 个复孔。正常 1640 培养基继续培养 24 h，然后加 60 μl MTT（5.0 g/L）溶液，置于 37 ℃，5%CO2 孵箱继续培养 4 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜 400 μl，振荡 10 min，用多功能酶标仪测定 570 nm 处吸光度（A），计算细胞增殖抑制率，其公式为IC50 24 h= （Acontrol-Atreat）/Acontrol × 100%，式中，IC50 24 h表示24 h细胞增殖抑制率，Acontrol表示空白对照组吸光度，Atreat表示试验组吸光度。

1.2.5.3 载药胶团在光照条件下对细胞毒性作用。将培养的 Hela 细胞用 0.25%的胰蛋白酶消化，吹打，制成单细胞悬液，调整细胞数约 1.0 ×105个/（ml·孔）接种于 24 孔培养板，置于37 ℃含5% CO2 的孵育箱中培养24 h。待细胞贴壁后弃去上清培养液，严格避光的条件下按试验设计加入不同浓度Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，在严格避光的条件下置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中继续培养孵育4 h，然后照光。采用波长630 nm的半导体激光进行照射，使光束均匀地垂直照射到24 孔培养板上，照射时间为180 s/孔，每孔设3个复孔。照光后置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中继续培养孵育24 h，然后监测细胞IC50。

1.2.6 统计方法。采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理，MTT法检测的细胞毒性之间的比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 载药胶团对细胞毒性的荧光显微镜观察 以 Hela 细胞为模型，加入投药量为 5%的 CSO-SA/Ce6，培养板在荧光倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。结果（图1）显示，加入载药胶团后，经过24 h后细胞数量和形态基本保持完好。

2.2 载药胶团对细胞毒性作用 采用四唑蓝比色法（MTT Assay）进行细胞毒性研究，考察 CSO-SA、Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在无光照条件下对Hela 细胞的毒性作用。结果显示，在无光照存在的条件下，载体、Ce6、CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6对细胞有一定的毒性，这种毒性是无选择性的，在杀死肿瘤细胞的同时也会造成对正常细胞及系统的损害，而理想的光敏剂药物则需要在无光照条件下，药物的毒性越小越好。Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包载后，对 Hela 细胞的24 h 半数致死量增加，IC50为89.72 mg/L，说明载药胶团可以降低药物的毒性。但CSO-SA/Ce6和FA-CSO-SA/Ce6对Hela 细胞的IC50 24 h则分别为 104.77和101.05 mg/L，没有明显差异。

2.3 载药胶团在光照条件下对细胞毒性作用

2.3.1 载药胶团在光照条件下对Hela 细胞毒性作用。 采用四唑蓝比色法（MTT Assay）考察Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6 在光照条件下对Hela 细胞的毒性作用。光敏剂在受到一定波长照射后，吸收光子能量，发生光敏化反应，产生单线态氧或其他活性氧物质，与多种生物大分子相互作用，损伤细胞结构或影响细胞功能，导致细胞死亡或凋亡，从而起到治疗肿瘤的作用。研究表明，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在630 nm、5 mA、照光180 s 的条件下，对Hela 细胞的毒性作用明显增加，其光动力细胞毒性PDT IC50分别为47.76、42.41和26.33 mg/L。

2.3.2 不同载药胶团的安全系数比较。采用细胞毒性IC50与光动力细胞毒性PDT IC50之比，表示载药胶团的安全系数，此比值越大，表示载药胶团本身的毒性越小、光毒性越大，安全系数越大。结果（表1）显示，CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 的安全系数分别达 2.11 和 3.84，光照后明显提高载药胶团对细胞的杀伤效应，说明用极小的光敏剂量就可以达到很好的光动力效应，其本身的毒副作用随之降低。

3 结论与讨论

该试验利用壳聚糖-硬脂酸嫁接物具有两亲性特征，在水中自聚形成胶团，以二氢卟吩e6为药物模型，合成了壳聚糖硬脂酸聚合物二氢卟吩 e6 载药胶团（CSO-SA/Ce6）和叶酸修饰聚合物的二氢卟吩 e6 载药胶团（FA-CSO-SA/Ce6）；以Hela细胞系为模型细胞，采用荧光显微镜观察载药胶团对细胞的毒性，采用四唑蓝比色法（MTT Assay）从细胞水平探讨了Ce6 载药胶团的细胞光动力杀伤效应，并与游离Ce6进行了比较；采用波长630 nm的半导体激光垂直照射到 24孔培养板上，照射时间为180 s/孔，继续孵育细胞24 h，应用MTT法检测载药胶团在光照条件下对 Hela 细胞的光动力杀伤效率。结果显示，在无光照条件下，Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包载后，对 Hela细胞的24 h半数致死量增加，说明载药胶团可以降低药物的毒性；在光照条件下，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 对 Hela 细胞的毒性作用明显增加；FA-CSO-SA/Ce6 的安全系数最大，说明用极小的光敏剂量就可以达到很好的光动力效应，其本身的毒副作用随之降低。

光动力效应的强弱受光源、组织氧浓度、光敏剂种类、光敏剂浓度、光源能量密度等诸多因素的影响，选择合适的条件是进一步提高Ce6的光动力学疗效，降低毒性的必要保证，有待于今后试验的深入研究。

[1] OCHSNER M.Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumor tumor[J].Photochem Photobiol B，1997，39（1）：1-18.

[2] LEVY J G.Photodynamic therapy[J].Tibtech January，1995，13：14-18.

[3] 许德余.肿瘤光动力疗法[M].北京：中国医药出版社，1996：7-28.

[4] PRIVALOV V A，LAPPA A V，SELIVERSTOV O V，et al.Clinical trials of a new chlorin photosensitizer for photodynamic therapy of malignant tumors[J].Proc SPIE，2002，4612：178-189.

[5] RICHTER A M，WATERFIELD E，JAIN A K，et al.Liposomal delivery of a photosensitizer benzoporphyin derivative monoacid ring A（BPD），to tumor tissue in a mouse tumor model[J].Photochem Photobiol，1993，57（6）：1000-1006.

[6] VARGAS A，PEGAZ B，DEBEFVE E，et al.Improved photodynamic activity of porphyrin loaded into nanoparticles：an in vivo evaluation using chick embryos[J].Int J Pharm，2004，286（1/2）：131-145.

[7] LIU S Q，WIRADHARMA N.Bio.functional micelles self.assembled from a folate.conjugated block copolymer for targeted intracellular delivery of anticancer drugs[J].Biomaterials，2007，28（7）：1423-1433.

[8] VERMA R S，GULLAPALLI S，ANTONY A C.Evidence that the hydrophobicuty of isolated，in situ，and de vivo.synthesized naove hurman placeotal folate receptors is a function of glycosyl.phosphatidylioositol anchonng to membranes[J].J Biol Chem，1992，267（6）：4119-4127.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5037-5038责任编辑 陈玉敏 责任校对 李岩