Survivin,shRNA促进HL—60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的研究

[摘要] 目的 研究RNA干扰Survivin基因表达对HL-60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的影响。 方法 采用PCR扩增以及定向克隆技术重组构建shRNA的表达载体pshRNA-Survivin，使用脂质体介导转染至HL-60细胞，分为6组：①空白实验组；②阿糖胞苷（Ara-C）组；③阳性质粒组；④阴性质粒组；⑤阳性质粒+Ara-C组；⑥阴性质粒+Ara-C组。采用RT-PCR技术检测HL-60细胞内Survivin及其mRNA表达，运用流式细胞仪进行细胞凋亡率改变的检测。 结果 与空白实验组比较，阳性质粒组的mRNA表达抑制率为57.7%，表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳性质粒组细胞凋亡率为5.87%，阳性质粒+Ara-C组细胞对Ara-C敏感性明显提高，细胞凋亡率为12.4%，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Survivin siRNA能够高效特异的抑制HL-60细胞内Survivin基因的表达，诱导细胞凋亡，并提高了HL-60细胞对Ara-C的敏感性，这有助于白血病基因治疗的进一步发展

[关键词] 阿糖胞苷；细胞凋亡；RNA干扰

[中图分类号] R55 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（b）-0025-04

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的重要成员，是由Ambrosini等[1]在1997年使用效应细胞蛋白酶受体-1（effecter cell protease receptor-1，EPR-1）的cDNA经杂交的方法从人类基因组文库中间筛选出来并完成鉴定，是到目前为止凋亡抑制作用最强的因子，Survivin蛋白能够调节全部细胞的分裂和存活[2]，其在包括急性髓系白血病的各种肿瘤组织中广泛表达，而在正常组织不表达[3]，说明Survivin参与白血病的发生与发展。Wheatley等[4]研究显示在给予高强度的多次化疗后的急性髓细胞白血病（AML）患者中，Survivin在其耐药组织中的表达显著高于对照组（P < 0.01），说明其与白血病的耐药性有关，是白血病基因水平治疗一个理想的靶点。RNA干扰是指dsRNA在RNaseⅢ内切酶Dicer作用下，产生了具有活性的21～23 nt小分子干扰性RNA，可介导同源互补的mRNA特异性降解，导致目的基因表达被阻断[5]。阿糖胞苷为抗嘧啶代谢药物，属于作用于S期的周期特异性药物，是AML的经典治疗药物[6]。本研究根据Survivin基因高表达于白血病细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因表达的特点，抑制Survivin基因的表达，使肿瘤细胞重新启动凋亡的级联反应，增加肿瘤细胞的凋亡以及对Ara-C的敏感性，为白血病的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

阿糖胞苷（0.1 g/5 mL）购买于美国法玛西亚公司，使用之前用自备的注射用水稀释到需要的浓度。AML细胞株HL-60购自上海细胞库，DNA内切酶、BamHⅠ限制酶EcoRⅠ限制酶、Marker DL2000为宝生物产品，shRNA载体pSIREN-DNR-DsRed-Express为宝生物产品，胎牛血清和IMBM培养基是hyclone产品，质粒提取试剂盒是Omega产品，RNA提取液Trizol以及脂质体Lipofectamine 2000是Invitrogen产品，逆转录试剂盒是Fermentas产品，PCR反应用品是天根产品。

1.2实验方法

1.2.1 shRNA的设计 Survivin基因序列来自GeneBank（编号NM001168），利用GenechemTMsiRNA设计工具，参照siRNA设计原则，在Survivin序列中间选择一段理论上最佳的片段，定为靶序列：5"-GGACCACCGCATCTCTACA-3"（78～96），根据靶序列设计对应的DNA序列，通过Blast分析证实其同人类其他的编码序列没有同源性。通过人工合成的方式制得2对互补同时编码对应短发夹siRNA的寡核苷酸链。

ShRNA-Survivin1（阳性）：

正义链：5"-GATCCGGAACCACCGCATCTCTACATCGTGCTCCTGGTTGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTG-3"；

反义链：5"-AATTCAAAAAAGGAACCACCGCATCTCTACACAACCAGGAGCACTATGTAGAGATGCGGTGGTCCG-3"。

ShRNA-Survivin2（阴性）：

正义链：5"-GATCCCCCAACGATCTGCACACGTTAGTGCTVV

TGGTTGACGTGTGCAGATCGTTGGGTTTTTTG-3"；

反义链：5"-AATTCAAAAAACCCAACGATCTGCACACGTCAACCAGGAGCACTAACGTGTGCAGATCGTTGGGG-3"。

注：下划线标示为连接酶连接位点。

1.2.2 shRNA的表达载体构建及鉴定 ShRNA-Survivin其寡核苷酸的正反义链由宝生物（大连）工程有限公司人工合成，两条互补的单链经变性，退火等相关步骤后组成双链ShRNA。ShRNA的表达载体pSIREN-DNR-DsRed-Express含有BamHⅠ、EcoRⅠ两个克隆点，对ShRNA其寡核苷酸的模板进行连接。运用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切割之后琼脂糖电泳，随后回收，运用T4型DNA连接酶进行作用，将ShRNA-Survivin1与ShRNA-Survivin2分别同载体相应的克隆点予以连接。获得的连接产物转化到大肠杆菌DH5а之后，选取琼脂板上的菌落进行增菌培养，通过PCR和测序鉴定证明ShRNA的序列连接是正确的，进行大量菌液培养以便提取出高纯度重组质粒，随后用来细胞转染。

1.2.3 细胞培养与转染 胎牛血清（FBS）占20%体积的IMBM培养基，于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中进行无菌细胞培养，培养细胞为悬浮生长。待细胞进入指数对数期铺6孔板，24 h后用FBS洗涤细胞两次并更换为无FBS的IMBM培养基，室温下10 μL Lipofectamine 2000与240 μL IMBM轻轻混匀，孵育5 min，取5 μL质粒与245 μL IMBM轻轻混匀，孵育5 min，将二者轻轻混匀，室温下孵育20 min，逐滴滴入6孔板，并轻轻晃动细胞板。6 h后更换为有血清的培养基，48 h后检测结果。

1.2.4 实验分组 实验分6组，①空白实验组：FBS占20%体积的IMBM培养基，于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱培养的处于对数期的细胞，约106个。②Ara-C组：取对数期细胞，约106个，加用阿糖胞苷，浓度约为5 μg/μL，相当于临床上一次用药量的1/250[7]。③阳性质粒组：按照上述转染步骤加入5 μL阳性质粒。④阴性质粒组：按照上述转染步骤加入5 μL阴性质粒。⑤阳性质粒+Ara-C组：按照上述转染步骤加入5 μL阳性质粒，48 h后加入5 μg/μL的Ara-C，作用24 h观察结果[8]。⑥阴性质粒+Ara-C组：按照上述转染步骤加入5 μL阴性质粒，48 h后加入5 μg/μL的Ara-C，作用24 h观察结果。

1.3观察指标

1.3.1 RT-PCR对Survivin mRNA表达的检测 运用Trizol提取细胞的总RNA，随后紫外分光光度计进行定量。采用逆转录试剂盒将RNA转录成cDNA。RT-PCR将细胞的cDNA作为模板，扩增Survivin、β-actin基因。利用Gene Fisher软件设计引物，Survivin正义链5"-TTGGCAGGT GCCTGTTGAAT-3"，反义链5"-AGCCAGTCCCCCACAGCA T-3"，目的基因465 bp。β-actin正义链：5"-GACAAC GGCTCC GGCATGTG-3"，反义链：5"-TGAGGATGCCTC TCTTGCTC-3"，目的基因166 bp。PCR反应条件：94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 85 s，72℃ 10 min，共30个循环。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集6组实验组细胞约1×106个，PBS漂洗2遍，1200 r/min，离心5 min，弃去上清，离心及弃上清步骤反复3次，之后加入已预冷的结合缓冲液并将细胞重悬，添加5 μL PI及5 μL Annexin V到悬液中，混匀以后于4℃避光处理，染色10 min，使用流式细胞仪进行细胞凋亡指数检测。

1.4统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的测序鉴定以及菌落的PCR结果

本实验得以成功构建可表达ShRNA-Survivin的重组质粒载体，通过测序证明，插入的ShRNA-Survivin序列是正确的。见图1、2。

2.2 RNA干扰对Survivin mRNA表达水平的影响

RT-PCR扩增产物行琼脂凝胶糖电泳分析，紫外等下见3、5两个干涉组细胞RT-PCR产物在465 bp位置处的条带明显弱于对照组的条带，内参β-actin mRNA在各组均能经RT-PCR扩增产生166 bp片段（图1）。与空白实验组和阴性质粒组比较，阳性质粒组细胞Survivin mRNA的表达抑制率依次是57.7%和56.9%，与Ara-C组、阴性质粒+Ara-C组比较，阳性质粒+Ara-C组细胞Survivin mRNA表达抑制率依次为79.9%和81.1%，差异有统计学意义（P < 0.05），这表明siRNA能够高效特异的抑制HL-60细胞内Survivin mRNA的表达，同时还明显提高HL-60细胞对于Ara-C的敏感性。见图3。

2.3 RNA干扰Survivin对细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪对6组细胞的凋亡情况进行检测，结果表明，阳性质粒组、阳性质粒+Ara-C组的细胞显示出明显细胞凋亡峰，而空白实验组、Ara-C组、阴性质粒组、阳性质粒+Ara-C组细胞未出现明显的细胞凋亡峰，细胞凋亡指数：阳性质粒组为5.87%；阳性质粒+Ara-C组为12.4%；Ara-C组为5.09%；阴性质粒组为2.78%；阳性质粒+Ara-C组为8.80%。空白实验组细胞基本无凋亡，与空白实验组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

3 讨论

RNA干扰是指向细胞内导入和内源性的mRNA编码区域内一段序列的同源双链RNA（dsRNA），进而使该mRNA特异性的降解，基因表达呈现沉默的一种现象[9]，目前RNAi已发展成为一种新的分子生物学实验技术，用于特异性降低或关闭一些基因表达，因而可以简化或替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具[10]。

阿糖胞苷属于一种细胞周期S期嘧啶类的抗代谢药品，通过对细胞内DNA合成的抑制，介导细胞凋亡，抑制肿瘤类细胞增殖等来杀灭S期的细胞[11]。采用阿糖胞苷进行白血病治疗的病例，伴随时间延长，体内会产生具有阿糖胞苷耐药性的细胞亚群，并且随着时间的延长而增加。推测出现这种现象的原因，阿糖胞苷使用后，残留的白血病细胞对常规用量阿糖胞苷的跨膜转运存在障碍，从而导致进入细胞的阿糖胞苷减少；也可能是因阿糖胞苷向阿糖尿苷转化，脱氧胞嘧啶脱氨酶的活性增大，使得其在血液中的分解速度加快，最终出现阿糖胞苷常规用量情况下具有耐药性细胞亚群产生[12]。

Survivin为IAP家族的一个重要成员，是由Pennati等[13]在1997年使用EPR-1的cDNA经杂交的方法从人类基因组文库中间筛选出来并完成鉴定，是到目前为止凋亡抑制作用最强的因子。Survivin蛋白能够调节全部细胞的分裂和存活，且在大多数的人类恶性肿瘤中表达，因此Survivin可作为基因水平治疗一个安全，特异，高效的靶点[14]。Moriai 等[15]研究表明，在HL-60细胞株中，Survivin mRNA的表达水平显著提高。有研究显示，在给予高强度的多次化疗后的AML患者中，Survivin在其耐药组织中的表达显著高于对照组（P < 0.01）。以上说明，Survivin参与白血病的发生发展，并与白血病的耐药性密切相关。

本研究成功构建可表达shRNA-Survivin的重组质粒载体，通过脂质体转染进入HL-60细胞，结果表明，重组质粒能够明显抑制Survivin mRNA表达，转染阴性质粒组与空白实验组表达没有显著性差异。细胞凋亡检测结果表明转染阳性质粒组细胞凋亡率显著高于转染阴性质粒组和空白实验组，而转染阴性质粒组与空白实验组没有显著性差异，可能是因Suivin直接或间接影响半胱氨蛋白水解酶发挥作用，从而使细胞凋亡受抑制。干扰Suivin则可以促进细胞凋亡。相同剂量阿糖胞苷作用下，转染阳性质粒组细胞对Ara-C敏感性明显高于转染阴性质粒组和空白实验组。

综上所述，Survivin siRNA能够高效特异的抑制HL-60细胞内Survivin基因的表达，诱导细胞凋亡，并提高了HL-60细胞对阿糖胞苷的敏感性。这为以Survivin作为标靶的肿瘤基因沉寂疗法在白血病治疗中的应用提供了一定的基础理论支持，有助于白血病基因治疗的进一步发展。

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（收稿日期：2012-11-29 本文编辑：李继翔）