抗肿瘤药物阿霉素和紫杉醇对Hela细胞增殖及凋亡的影响

摘 要：本次实验以Hela细胞为原材料，选择阿霉素（Adriamycin）和紫杉醇（Paclitaxel）作为实验抗肿瘤药物，用MTT比色法测定细胞数目探究不同浓度的阿霉素和紫杉醇对细胞增殖的影响，用Hoechests-PI双染法探究两种药物对细胞凋亡的影响。经过为期两周的实验我们得出的结果是在阿霉素的作用下Hela细胞的IC50值为12.53μg/ml，在紫杉醇的作用下细胞的IC50值为10.97μg/ml。加入半数抑制药物浓度后用显微荧光拍照可观察到紫杉醇和阿霉素均能抑制细胞增殖，降低细胞活力，明显提高死亡和不健康细胞比例。

关键词：Hela细胞；阿霉素；紫杉醇；IC50；细胞凋亡；MTT比色法；Hoechests-PI双染法

中图分类号：R73-361 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）22-0203-04

1 前言

近年来，癌症的频发和高致命性引起了人们越来越多的重视，针对癌症细胞的治疗药物的研究也在蓬勃发展。紫杉醇和阿霉素是典型的抗癌药物，对癌症细胞有着明显的杀灭和抑制作用：

（1）紫杉醇（Paclitaxel），进口药商品名为Taxel，简称PTX。紫杉醇是M期的植物类药物，对乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌获得较好的疗效。分子式为C47H51NO14，其性状是五色透明或略带黄色的粘性溶液。具有高度亲脂性，不溶于水。PTX是1971年从短叶紫衫树皮中提取的具有抗肿瘤作用的活性物质。PTX能特异性结合到微管导致微管聚合成团块和束状，而抑制微管网的正常组装。另外其不良反应为严重骨髓抑制。

（2）阿霉素（Adriamycin），也称为14-羟基柔红霉素，简称：ADM，DOX，DXR，分子式为C27H23NO11，其形状是盐酸盐为橘紅色针状结晶或橙红色粉末，呈疏松块状。易溶于水，微溶于甲醇，几乎不溶于丙酮、乙醚或氯仿。其水溶性的稳定性依赖于pH，在酸性水溶液中大致稳定，在碱性溶液中不稳定。ADM是由Di Marco等从一种链霉菌变异株发酵液中提出的糖甙抗生素。化学结构与DNA相似，仅在侧链14位碳原子上尉羟基。1968年动物实验证实ADM有抗肿瘤作用，同年进行了临床试验。ADM可嵌入DNA的相邻碱基对之间，使DNA链裂解，阻碍DNA及RNA的合成。对S 期最敏感，M期其次，而对G1期敏感性较差。另外其不良反应为骨髓抑制，发生率为60%-80%；心脏毒性，6%-30%。

Hela细胞系（HeLa cell line）是生物学与医学研究中使用的源自一位名叫Heietta Lacks美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞系，是由人类乳突状瘤病毒第18型（Human Papillomavirus 18）转化的，常用作癌症细胞模型（model cancer cells）研究。与其他癌细胞相比，HaLa细胞系增殖异常迅速，因此本实验以HaLa细胞系为实验材料，对紫杉醇和阿霉素的抗癌性进行研究。

2 材料与方法

2.1 MTT比色法

MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐，黄色）能被活细胞线粒体脱氢酶还原成不溶于水的蓝紫色产物甲鐕（formazan），后者被溶解后所呈现的色度则反映活细胞的代谢水平。死细胞上述无脱氢酶活性。因此formazan产生的量与活细胞数量成正比。MTT比色法的优点是简单、快速、较准确。因而被广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验分析。具体实验流程如下：

（1）将HeLa细胞悬液按照设计好的浓度（每孔1*104个细胞）经稀释后接种到96孔培养板中，每孔加稀释后的细胞悬液0.2mL。设定无细胞孔位调零组，每组设6个平行孔；

（2）待细胞贴壁后（或次日），吸出培养基，加100uL新鲜的培养基和10uL MTT，培养4小时后加100uL裂解液，继续培养16小时（或过夜）；

（3）用酶标仪测定OD值，检测波长490nm或570nm。

本实验中利用MTT比色法检测在同一药物的不同浓度下细胞的成活率，进而分析比较紫杉醇和阿霉素这两种药物对HeLa细胞的作用效果，并进一步计算出这两种药物的IC50值。

2.2 Hoechst-PI双染色

PI（碘化丙啶）：双链核酸标记物，亲水性，不能通过完整细胞膜，激发光谱和发射光谱分别为535nm和617nm，激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可作为激发光。Hoechst 33342：特异结合AT区的DNA标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别为350nm和461nm。Hoechst-PI双染色能够通过颜色有效区分正常细胞、凋亡细胞与坏死细胞，具体情况如表1所示。

Hoechst-PI双染色的实验流程为：

（1）提前药物处理细胞；

（2）用滴管将培养液全部转移到试管中，胰酶消化细胞，用收集的培养液吹打，制备细胞悬液，将细胞悬液转入试管中1000r/min，离心5min，弃上清；

（3）用1ml PBS重悬细胞，转入1.5ml微量离心管中，1000r/min，离心5min，弃上清，500μL PBS重悬，取178μl转入0.5mL的微量离心管中，加入20μL PI（终浓度100μg/ml），2μL Ho.33342（终浓度10μg/ml），混匀，37°C温箱中避光标记15min；

（4）1000r/min，离心5min，弃上清，加50μL PBS重悬，取10μL滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起），保存于暗处；

（5）荧光显微镜，紫外激发，观察并计数。

2.3 结果与讨论

2.3.1 MTT比色法（第一次实验）

（1）紫杉醇：

（2）阿霉素：

由表4可计算出：不同药物浓度情况下OD值得变化情

由表5得出曲线如图2所示。

（3）结果分析：

由实验结果中的96孔板OD值可以看出，紫杉醇和阿霉素药物处理过后，结果显示：96孔板中，平行孔之间的差别较大，不太具有显著性；且数据出现了0甚或是负值，数据不甚合理。

对所得数据进行处理，用所使用的药物浓度及相对应的平均OD值列出表格并绘制关系曲线，所得曲线如图所示，紫杉醇和阿霉素的处理结果变动剧烈均不成规律，毫无统计学意义。

误差原因分析：（1）药物浓度梯度设计差异过小，加样枪在小剂量范围内误差范围过大，导致实验结果各浓度之间的差异不够明显；（2）仪器存在一定的误差，导致在小范围内结果会产生较大的波动；（3）药物处理时间过长，细胞死亡数量过多，存活数量过少，OD值之间变化不明显；（4）排枪的误差较大，在加样是会产生一些误差，导致结果产生波动。

综上所述，本次实验结果较为失败，因此决定重做本实验。

2.3.2 MTT比色法（第二次实验）

（1）紫杉醇：

由表6、表7得出曲线如图3所示。

（2）阿霉素：

由表8可计算出：不同药物浓度情况下OD值得变化情况。

由表9得出曲线如图4所示。

（3）结果分析：

由实验结果中的96孔板OD值可以看出，紫杉醇和阿霉素药物处理过后，结果显示：96孔板中，平行孔之间数值比较接近，具有显著性；数据合理清晰。

对所得数据进行处理，用所使用的药物浓度及相对应的平均OD值列出表格并绘制关系曲线，所得曲线如图所示，紫杉醇和阿霉素的处理结果药物浓度与OD值之间成线性关系，清晰明了，符合规律，具有极强的统计学意义以及数学计算意义。

因此可由实验结果进行进一步的计算：

IC50（紫杉醇）=10.97μg/ml

IC50（阿霉素）=12.53μg/ml

由计算结果可知：紫杉醇的IC50浓度大致合理，但是阿霉素的IC50浓度偏高，与理论值不合，分析原因可能为：（1）所用药物稀释时稀释倍数有所误差，导致结果不合理论；（2）所用标准药物的浓度与老师告知的浓度不符，导致结果误差较大。

3 细胞周期时相及药物对细胞核的影响

所有染色细胞统一由PI和Ho.33342双染色，其中PI可以通过嵌入双链DNA后释放红色荧光，将细胞核染成红色，但由于PI不能穿透活细胞膜，因此只能染色死细胞；Ho.33342能在不杀死细胞的前提下，将细胞核染成蓝色，因为它是少数的能直接穿透细胞膜的染剂。结合PI-Ho.33342双染的结果，能展示阿霉素和紫杉醇对细胞核的影响，从而得出这两种药物对细胞周期的影响。

阿霉素可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀伤作用，其作用机理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成。

紫杉醇粗提取物在筛选实验被发现对离体培养的鼠肿瘤细胞有很强的抑制活性。它能阻断微管的形成，具有周期依赖性。

3.1 阿霉素对细胞核的影响

用PI和Ho.33342染色细胞核经过荧光显微镜显色后的影像如图（添加阿霉素的实验细胞如A图，未添加阿霉素的对照组细胞如B图）。无论是对照组还是实验组的细胞，都有蓝色和紫红色两种染色区域，但可以明显看出，对照组的细胞活力要明显好于实验组。原因是，阿霉素能抑制DNA和RNA的合成，是广抗瘤的周期作用药物，施用了这种抑制型药物，癌细胞的活力明显减弱，并且在本次实验中，阿霉素的浓度过高，超过了普遍得出的阿霉素对于823细胞的IC50值，阿霉素对细胞的伤害更广更大。

同时，染色的红色越深，表示细胞膜破损越严重，PI进入细胞核的量越多，意味着坏死的细胞较多，而图中也有细胞核蓝色但核形态不健康的个体，这可能是即将凋亡的细胞，但由于其细胞膜的通透性还保持，因此PI不能进入。

由图可见，加入阿霉素后，细胞密度降低，对比同体积对照组细胞密度，可以推测阿霉素阻碍了细胞的增殖能力，使得细胞数量减少，新细胞不能产生；同时，加入阿霉素药物后，细胞活力减弱，死亡和不健康的细胞比例明显提高。因此可以推测阿霉素对细胞生长确实有负面作用，能造成细胞的增殖抑制和死亡。

3.2 紫杉醇对细胞核的影响

用PI和Ho.33342染色细胞核经过荧光显微镜显色后的影像如图（添加紫杉醇的实验组细胞如C图，未添加紫杉醇的对照组细胞如D图）。都有蓝色和紫红色两种染色区域，原因是，紫杉醇能抑制微管的合成，而微管的形成直接关联细胞中心体的形成，因此施用了这种抑制型药物，癌细胞的活力明显减弱。

由图可见，加入紫杉醇后，细胞密度降低，对比同体积对照组细胞密度，可以推测紫杉醇阻碍了细胞的增殖能力，使得细胞数量减少，新细胞不能产生，可能和紫杉醇对细胞增殖的影响有关；同时，加入紫杉醇药物后，细胞活力减弱，死亡和不健康的细胞比例明显提高。因此可以推测紫杉醇对细胞生长确实有负面作用，能造成细胞的增殖抑制和死亡。

4 结语

本次实验利用MTT法得出IC50值后，用此浓度的药物作用于肿瘤细胞，得到了较明显的抑制效果。但本次实验只是对抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制效果的初探究，现我国癌症形势严峻，发病率和死亡率逐年提升，研究开发出经济有效的抗癌药物刻不容缓。希望通过本次实验，我们能对抗癌研究有初步了解，也希望我国的抗肿瘤研究之路走得更远。

参考文献

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