大鼠骨癌痛模型中血—脊髓屏障通透性的变化

材料与方法

1.1 实验动物与分组

雌性Wistar大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。体重70～80 g 10只用于培养腹水瘤；体重160～180 g 69只，随机分为三组，正常组13只（不实施手术），骨癌痛组28只（胫骨内接种肿瘤细胞）及假手术组28只（胫骨内注射PBS），其中每组8只进行痛行为学实验，其余按时间点取脊髓腰膨大进行免疫组化实验。动物分笼饲养，12 h/12 h昼夜交替，室温控制在（22±1）℃，自由饮水摄食，在实验环境中适应1周后进行实验。在对动物实施外科手术及进行疼痛研究的实验过程中，严格遵守国际疼痛协会（IASP）有关动物保护的规定。

1.2 胫骨癌痛模型制作方法

制作模型应用的肿瘤细胞是来自于Wistar大鼠的Walker 256乳腺癌细胞（购自上海生物医学工程研究所）。复苏腹水瘤细胞，取1 mL（约2×107个细胞/mL）接种至幼年70～80 g雌性Wistar大鼠腹腔内，7～10 d后抽取腹水，离心清洗后以PBS重悬计数，调节细胞浓度至1×107个细胞/mL。腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉160～180 g大鼠，右侧膝关节部备皮，70%酒精消毒皮肤。左手固定膝关节，用7号针头在膝关节髌韧带内侧缘沿胫骨纵轴往胫骨远端钻孔，深约1 cm，然后换用吸有肿瘤细胞的微量进样器，往骨癌痛组大鼠胫骨骨髓腔内注射4 μL肿瘤细胞，假手术组大鼠注射等量PBS，最后均推入2 μL凝胶海绵溶液封口，留针30 s。正常组大鼠不实施手术。癌痛模型以接种肿瘤细胞侧胫骨内出现肿瘤组织为模型成功标准[4]。

1.3 机械性痛觉超敏测定

安静环境中，室温20～22℃，大鼠置于底为网格的特制有机玻璃盒子内，适应20 min后，待动物处于放松状态时开始检测，采用一系列von-Frey细丝（1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g），从小到大垂直刺激大鼠后肢足掌中心部位。最小能引起缩爪反应的纤毛压力即为大鼠的缩爪反应阈值，以此来反映大鼠的机械性痛觉超敏情况。具体操作方法见参考文献[5]。按上述方法术后第2天开始隔天测定大鼠机械性痛阈值直至术后第16天。

1.4 免疫组织化学实验

大鼠在10%水合氯醛（4 mL/kg，腹腔注射）麻醉下，经4%多聚甲醛灌注固定后，取出脊髓腰膨大节段，置入20%的蔗糖中4℃过夜，然后换入30%蔗糖（4℃），直至组织沉底，OCT包埋，冠状冰冻切片，片厚25 μm，收集切片于0.01 mol/L PBS中，封闭液37℃孵育2 h；然后与星形胶质细胞标志物GFAP（Sigma公司，1∶500）抗体或白蛋白抗体（Sant Cruze公司，1∶50）4℃孵育过夜；0.01 mol/L PBS漂洗后依次加入生物素化的二抗、亲和素-生物素-过氧化物酶孵育，3，3-二甲基联苯胺（DAB）显色。显色完成后将切片置于载玻片上，干燥，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树胶封片。在光学显微镜下观察拍照。采用双盲法人工计数脊髓背角阳性细胞的数量，每个动物取5张脊髓切片，每组5个动物。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.3统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA）。以P < 0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓背角白蛋白免疫阳性细胞数量的变化

正常组大鼠及假手术组大鼠脊髓内没有检测出白蛋白免疫阳性细胞，在接种肿瘤细胞后，骨癌痛组造模侧的脊髓背角内能够观察到阳性细胞及较弥散的颗粒，在术后第16天阳性细胞的数量增长较多，细胞的形态也更加清晰，且在对侧也有同样的变化趋势。

2.2 脊髓背角星形胶质细胞的数量变化情况

正常组大鼠与假手术组大鼠脊髓背角内的星形胶质细胞数量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。与正常组相比，骨癌痛组接种肿瘤细胞后第4天开始不仅大鼠造模侧脊髓背角内的GFAP免疫阳性细胞数量增加，即星形胶质细胞数量增加（表1），而且星形胶质细胞的形态也发生了变化（图2）。在正常组及假手术组脊髓背角内星形胶质细胞的突起呈网状分布，排列较整齐，胞体的形态不清晰，而接种肿瘤细胞后，骨癌痛组星形胶质细胞的突起逐渐变得粗大，相互重叠，胞体形态清晰可见，对侧也有相同的趋势。

2.3 机械性痛阈值变化

采用大鼠造模前von Frey细丝测定机械性痛阈值作为基础值，造模后第2天开始隔天测定大鼠机械性痛阈值。结果显示，在造模侧，与正常组大鼠相比，骨癌痛组和假手术组在术后第2天机械性痛阈值开始下降，但在术后第6天以后，假手术组与正常组相比差异无统计学意义（P > 0.05），而骨癌痛组机械性痛阈持续下降，接种后第16天降至观察中的最低点。在对侧，骨癌痛组和假手术组术后机械性痛阈值也出现降低，从术后第6天开始，假手术组恢复到正常水平，而骨癌痛组机械性痛阈同正常大鼠相比仍具有显著性差异（P < 0.05）。见图3 。

3 讨论

本研究所应用的胫骨癌痛模型是比较成功的骨癌痛模型，被国内外文献广泛报道[4]，并首次在这一模型上发现了血脊髓屏障的破坏。在正常情况下，内生白蛋白不能透过血管内皮细胞进入脊髓，但是在一些病理状态下，如缺血疼痛造成的屏障破坏致使在脊髓内可以发现白蛋白免疫阳性细胞。一些文献报道，血脊髓屏障的破坏和白蛋白的漏出具有很好的相关性[6]。因此，笔者应用了免疫组织化学方法检测了脊髓背角内的白蛋白免疫阳性细胞，以判断血脊髓屏障通透性的变化。

研究发现，在大鼠胫骨癌痛模型造模后的第4天脊髓背角内就出现了白蛋白免疫阳性细胞和较弥散的颗粒，阳性细胞具有神经元形态。脑及脊髓外伤可导致神经元对内生蛋白的摄取增加。在缺血模型中白蛋白免疫阳性的神经元及其细胞核则代表了死亡的细胞[6]。这也说明了在造模后第16天出现的白蛋白免疫阳性细胞数量明显增加及轮廓更加清晰，有可能是神经细胞的大量死亡所引起的。

在这一模型中，笔者认为造成血脊髓屏障破坏的原因部分可能是胫骨癌痛。有文献报道，在炎性痛及神经痛中存在血脑及血脊髓屏障的破坏[6-9]。而事先应用局麻药利多卡因或者布比卡因抑制疼痛可阻止屏障的破坏[3，7]。这说明是由于疼痛刺激引起了屏障的破坏。疼痛引起屏障的破坏主要是通过影响血脑及血脊髓屏障的结构。内皮细胞之间的紧密连接是组成血脑及血脊髓屏障的重要部分。紧密连接主要由三种结合膜蛋白质组成，即claudin-5、occludin、JAM（连接黏附分子），还有一些细胞质内的辅助蛋白，如ZO-1等。胞质内的辅助蛋白能将膜蛋白连接到细胞骨架蛋白Actin上，维持内皮细胞的形态及功能的完整[10]。在神经痛模型中发现，ZO-1及occludin表达下调[2]。在炎性痛模型中，occludin表达下降[8]，occludin低聚合物解聚[11]，ZO-1、Actin、claudin-5表达增加[3]。这也表明疼痛模型不同，对紧密连接的影响也不大相同。紧密连接的组成和功能也能被许多信号分子调节，如cAMP、Ca2+、G蛋白、磷脂酶C、甘油二酯、小G蛋白、蛋白激酶C等[8]，还有一个重要结构是细胞质膜微囊，内皮细胞通过胞吞胞吐可以从血液转运物质进入神经系统。细胞质膜微囊的支架蛋白Caveolin-1是其重要组成部分[12]，在部分坐骨神经结扎模型中，Caveolin-1的减少在CMP-1的存在下可以使得紧密连接的辅助蛋白遭到破坏，从而也影响了屏障的完整[13]。另外，许多急、慢性痛的模型中，循环及中枢神经系统内有各种炎性介质，在疼痛的发生及发展中起着重要的作用，同时这些炎性介质也调节了血脑及血脊髓屏障的开放。ICAM-1是免疫球蛋白表面受体，可以改变内皮细胞的骨架形态，导致循环中的免疫细胞的浸润[14]。由激活的神经元分泌的MCP-1能够通过内皮细胞上的CCR2开放屏障，促进免疫细胞的浸润[15]。由免疫细胞分泌的促炎细胞因子IL-1β也可以促进屏障的开放，而抗炎因子IL-10可以促进屏障的恢复[2]。TGF-1β激活内皮细胞表面受体AKL-5，通过下游Smad2/3信号通路调节屏障的通透性[2，16]。

本研究检测的脊髓背角正是疼痛调节的重要部位。在这一模型中也发现了脊髓背角内的星形胶质细胞的双侧激活。大量的文献证明，星形胶质细胞在疼痛的维持阶段起着重要的作用[17]。同时星形胶质细胞也是血脊髓屏障的重要组成部分，其数量及形态的变化就有可能会影响到血脊髓屏障的通透性。星形胶质细胞可以通过多条信号通路与内皮细胞交流，其共同培养可以促进紧密连接的形成，星形胶质细胞产生的多种物质，如谷氨酸、天门冬氨酸、牛磺酸、内皮素-1、ATP、NO、MIP-2、TNF-α等都会对屏障产生影响[10]。在笔者的研究中，血脊髓屏障的破坏和星形胶质细胞的增生同时出现，但是变化的时程并不一致。笔者推测后期星形胶质细胞形态的改变可能更进一步地增加了其通透性，强烈的疼痛造成了神经细胞功能的改变，对蛋白摄取增加，使蛋白沉积在神经细胞内，这些都造成了最后白蛋白免疫阳性细胞数量增加及染色加深。另外，在背根神经切断的神经痛模型中，发现星形胶质细胞的增生肥大与血脊髓屏障破坏的时程相一致[6]。本研究的发现也可能说明了癌性疼痛和神经痛在机制方面存在着不同。

目前，对于疼痛引起血脑及血脊髓屏障破坏机制方面的研究还较少。缺乏研究血脊髓屏障的工具药物阻碍了对其相关机制进一步地探索。随着研究方法及药物的完善，不断揭示的相关机制可能为疼痛的治疗提供新的方法。

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（收稿日期：2012-08-28 本文编辑：程 铭）