反义ＲＮＡ在细菌、病毒研究中的进展

[摘要] 反义RNA（asRNA）不仅可以调节真核生物基因表达，而且在细菌和病毒中也有沉默基因作用。耐药细菌不断增加，而发现具备新作用机制的抗生素已经非常困难，asRNA可以增敏细菌对潜在抗生素的作用，在发现新抗生素方面有应用价值。目前缺乏对人类1型免疫缺陷病毒（HIV-1）和人类乳头瘤病毒16型（HPV-16）感染的有效治疗措施，asRNA对这两种病毒有多个作用靶点，有希望发展成治疗病毒感染的有效药物。

[关键词] asRNA；增敏；抗生素；HIV-1；HPV-16

[中图分类号] R34[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）06（a）-031-03

Advances of antisense RNA for bacteria and viruses

WANG Xiao-yan, WANG Xiu-fang, LU Zhan-jun*

(Department of Laboratory Animal Science, Genetics Staff Room, Hebei Medical University, Shijiazhuang050017, China)

[Abstract] Antisense RNA(asRNA) silence gene in eukaryotic cells and in microorganism. Examples of drug-resistant bacteria are increasing while the discovery of new antibiotics with new mechanisms of action has been essentially nonexistent. asRNAs are being applied in the discovery of new antibiotics since they enhance the sensitization of bacteria to potential antibiotics. Effective measures for treating patients with infections of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human papillomavirus type 16 (HPV-16) are absent. Both HIV-1 and HPV-16 have various effective targets for asRNAs that may develop new therapeutic drugs for curing infection of the viruses.

[Key words] asRNA; Enhancing sensitization; Antibiotics; HIV-1; HPV-16

反义RNA通过影响转录，转录后和翻译调节基因表达。尽管asRNA沉默基因机制与RNA干涉（RNAi）有类似之处，但是两者并不完全相同。HelF为一种RNA螺旋酶，属于RNAi的核抑制剂，在缺失HelF的细胞中，RNAi作用增加，asRNA沉默基因作用不变[1]。反义核酸技术包括asRNA，asDNA，修饰的RNA等，其中asRNA在细胞自然状态下可以发生，参与正常生理调节[2，3]。asRNA在细菌和病毒研究方面有一定的应用价值。

1 asRNA技术在新抗生素发现中的应用

耐药细菌不断增加，而发现具备新的作用机制的抗生素已经非常困难。为了治疗耐药菌感染以满足临床需求，使用新的方法寻找抗生素是当务之急。虽已证明在细菌中存在数百种蛋白质可以做为潜在的抗生素靶向分子，但是目前只发展出针对这些蛋白质中少数的治疗药物。以反义核酸为基础的靶向作用可以增敏葡萄球菌，为特异性靶向抗生素的发现提供了高敏感性方法[4]。脂肪酸生物合成途径中的缩合酶(FabH/FabF)是细菌代谢所必需的，缺乏缩合酶(FabH/FabF)的细菌不能生长。将待检放线菌产物接种携带FabH/FabF asRNA质粒的细菌平板，同时接种不携带该种质粒的细菌平板，观察抑菌圈的差异，可以迅速高通量筛选靶向FabH/FabF的抗生素[5]。

为了改善asRNA表达引起基因沉默的效果，在大肠埃希菌中，用不同基因做靶，系统改变了asRNA的若干参数，发现侧翼反向重复产生配对双链RNA末端（PT）结构效果良好。靶向醋酸激酶-磷酸转乙酰酶基因操纵子（ackA-pta）的 PTasRNA引起ackA mRNA降解，ackA 活性降低78%。PT结构对于改善asRNA沉默脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶（fabI）基因也有效，fabI PTasRNA能够抑制敏感细胞生长[6]。

2asRNA下调细菌基因表达

2.1 细菌生理

asRNA参与细菌的生理调节，包括转录终止、生物合成等。在大肠埃希菌基因组中的非编码RNA(ncRNA)基因可以通过一种新的数学模型索引(Gapped Markov Model Index，GMMI)识别。运用大肠埃希菌基因组中sigma70 启动子和rho-终止子的参照序列获得可能的转录单位，用GMMI评价，得到133个ncRNA候选基因，其中包含29个先前已经注释的小RNA基因和46个可能的反义ncRNA，12个基因的转录物（包括5个asRNA）已经通过表达分析证实。这些数据提示在大肠埃希菌中asRNA的表达可能比以往认识的要多[7]。

铁转运生物合成基因簇（ITB）操纵子在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)含四个铁转运基因（fatD,-C,-B,和-A）和两个铁生物合成基因（angR和angT），ITB在该细菌毒力机制中起重要作用。fat部分的转录水平是全长基因转录水平的17倍，这种差异基因表达是由于只有少数转录物到达基因末端，大部分转录物在fatA 和angR基因之间终止，该过程可能需要一个427nt长的asRNA结合在基因间序列作为一种新的转录终止因子发挥作用[3]。

抑制纤维体中主要纤维素酶（Cel48F）合成可以改变解纤维素梭菌（Clostridium cellulolyticum）产生的纤维素酶组成。ATCC35319菌株(pSOSasrF)过量产生496nt长度的asRNA，该asRNA针对cel48F mRNAs核糖体结合位点和编码起始区域，使纤维素分解活性减少30%[8]。

2.2 实验研究

使菌体中针对特定基因的asRNA水平上升，导致基因表达减弱，是否影响细菌的生理功能与所针对的基因有关。先前的工作证明一组α/β型小分子，酸溶性的芽孢蛋白(SASP)与产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）的芽孢与湿热抵抗性有关。这个结论是以缺失三个SASP 蛋白质基因中一种的C型产气荚膜梭状芽孢杆菌芽孢为依据作出的。使用asRNA降低C型产气荚膜梭状芽孢杆菌SASP水平达90%，这些芽孢明显地降低了对湿热和紫外线的抵抗性，但对干热的抵抗不降低，这些结果与用缺失实验所得结论一致[9]。

RNAI基因产生的asRNA负向调节葡萄球菌多重耐药质粒（pSK41）的复制，pSK41质粒的RNAI启动子突变，导致该质粒拷贝数目明显增加，拷贝数目比野生型高约40倍。通过rep（复制起始蛋白）控制区和cat报告基因转录和翻译，评价RNAI突变在Rep表达中的作用。当RNAI启动子破坏时，rep mRNA的数量增加和翻译增强，反式（trans）提供RNAI后这种增强作用被逆转，证明RNAI asRNA在转录和翻译两个水平起负向调节作用，其最大抑制作用发生在rep翻译起始阶段。RNA的次级结构分析和通过突变获得数据提示，RNAI asRNA介导的rep翻译起始抑制是通过一种新机制，RNAI asRNA的结合促使rep mRNA前导序列的空间构象转变，形成稳定的茎环结构，封闭rep的翻译起始区域而抑制转录[10]。

在所有生物中，mRNA降解是控制基因表达的重要机制，mRNA降解速率直接影响到mRNA的浓度，从而影响蛋白质合成。在大肠埃希菌中RNase E（RNA酶E）对于大多mRNA降解有重要作用，RNase E对于细菌生存是必须的，敲除RNase E的突变菌不能存活。在大肠埃希菌中，asRNA可以显著下调RNase E的水平，但是asRNA的表达并不负向调节细菌生长。通过核酸杂交荧光检测（a fluorescence based sandwich hybridisation assay）发现，四环素诱导后RNase E asRNA分子增加25倍，在生长平台期之前每个菌体平均有400个以上asRNA分子，到平台期asRNA明显减少[11]。

3 asRNA抗HIV-1、HPV-16

3.1 asRNA抗艾滋病病毒

HIV-1是一种逆转录病毒，asRNA可以干扰HIV-1不同环节，有望成为治疗艾滋病的新方法。

具有鸟嘌呤字符串的DNA和RNA寡核苷酸有助于形成包含鸟嘌呤四聚体（G-quadruplexes）的稳定次级结构，HIV-1包含聚嘌呤区，能够形成鸟嘌呤四聚体的稳定折叠结构。肽核酸是一类DNA类似物，以氨基酸取代糖磷酸主链。在体外和细胞中，靶向HIV-1聚嘌呤区的寡嘧啶肽核酸（pyrimidine peptide nucleic acid，PNA）可以侵入折叠的RNA；T丰富的PNA（C4T4CT4）与聚嘌呤区形成三链结构，而C丰富的PNA（TC6T4CT）与聚嘌呤区形成双链结构，在聚嘌呤区靶部位特异性妨碍翻译延伸[12]。

过去曾一度设想，逆转录病毒不存在反义基因，但是随着在人类HTLV-1（T细胞白血病病毒1型）和HIV-1发现反义基因，改变了对逆转录病毒的认识[13,14]。HIV-1的长末端重复序列（LTR）包含一个反义基因，与已知HIV-1序列比较发现，潜在的转录起始元件位于HIV-1启动子和转录起始位点的下游，并处于相反的方向。该反义基因转录的asRNA对病毒固有RNA可能有巨大调节能力，因为它与所有的HIV-1有义RNA转录物在开始区域有25个核苷酸重叠。LTR区域也可以编码HIV反义蛋白 (HIV antisense proteins, HAPs)，在一些HIV-1感染长期存活者体内该区域已删除，表明HAPs可以作为发展疫苗的潜在靶点[14]。

HIV趋化因子受体CXCR4 和CCR5对于HIV-1进入细胞是必需的，并且从HIV感染到形成AIDS病涉及从CCR5到 CXCR4共受体使用转换。小的单链asRNA呈递给外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells）可以导致CXCR4 和CCR5受体mRNA选择性降解，引起基因沉默。这些受体有望做为治疗介入的靶点[15]。

联合治疗可以出现协同作用，有些情况也会产生拮抗。ASPsi-gag是病毒包装信号和内部结构蛋白编码基因，用针对ASPsi-gag的asRNA和针对外壳蛋白基因（env）编码区域的核酶联合基因治疗，观察对HIV-1病毒复制的抑制作用。在CD4+ T细胞系中核酶抑制HIV-1病毒复制，但是ASPsi-gag asRNA几乎无效，核酶抑制HIV-1作用比asRNA有效。核酶与asRNA共表达的细胞中，HIV-1的抑制低于单独表达核酶的细胞。这可能是因为共表达的asRNA促进了核酶降解[16]。

3.2 抗乳头瘤病毒

HPV感染对于子宫颈癌发生是重要的危险因素，HPV-16 E6 E7基因对子宫颈癌有协同致癌和促进作用，E7癌基因可以使培养上皮细胞永生化和增加细胞转化。运用不同载体使细胞中E6 E7 asRNA表达上升，携带E6 E7基因的子宫颈癌细胞发生增殖抑制、凋亡等改变，这些方法有可能对HPV-16 E6 E7阳性的子宫颈癌有治疗作用。

将产生E6 E7 asRNA的真核表达载体（pEGFP）转染人子宫颈癌细胞株SiHa，用RT-PCR、Western印记和流式细胞技术分析，HPV-16 E6 和E7原癌基因被成功抑制，导致肿瘤细胞的凋亡和衰老。asRNA转染引起的HPV-16 E6和E7下调，导致了p53表达增加和p105Rb磷酸化水平升高[17,18]。用重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus)转基因，表达反义HPV-16 E7，在体外能抑制细胞增殖，诱导凋亡，减少细胞迁移，在体内抑制HPV-16/HPV-18阳性子宫颈癌CaSki细胞增殖[19]。表达HPV-16 E7 asRNA的单纯疱疹病毒载体，感染CaSki细胞，有效下调HPV-16 E7 mRNA和E7蛋白质[20]。

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（收稿日期：2008-05-06）