不同光质条件下铁皮石斛多糖含量与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因表达变化

材料，研究不同光质下铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和多糖积累的差异。结果表明：红、蓝和绿3种光质下多糖含量、PEPC活性和PEPC基因表达量变化趋势基本一致，表现为红光>蓝光>绿光；在白光下则出现显著差异，呈现出基因表达量低、酶活性高、多糖含量高的特征，显示出光质对光合代谢调控的复杂性。

关键词 光质；铁皮石斛；多糖含量；PEPC活性；PEPC基因表达量

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract The effects of light quality on polysaccharide accumulation， PEPC activities and PEPC gene expression were investigated in Dendrobium officinale. The results showed that the change trends of PEPC activities， polysaccharide contents and PEPC expression levels were consistent in the descending order red light， blue light， reen light， whereas they appeared significantly different in the white light， showing lower PEPC gene expression-level， higher PEPC activities， and more polysaccharide accumulation， which implied the complexity of the regulation of different light quality on the photosynthetic metabolism.

Key words Light quality； Dendrobium officinale； polysaccharide content； PEPC activity； PEPC gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.009

光质对植物的生长、发育和代谢有一定的调节作用。目前，关于光质对植物光合作用的影响已开展了多方面的研究，取得了大量的试验成果。在生产中，有色塑料薄膜已开始被应用于作物的设施栽培，不同颜色的塑料薄膜被作为非化学手段来调节植物生长[1]。有研究表明光质参与调控植物的光合作用[2]、代谢生理[3-5]及基因表达[6-8]等过程，但光质对铁皮石斛光合产物合成及基因表达水平的影响的资料仍很缺乏。铁皮石斛（Dendrobium officinale）为 CAM（景天酸代谢途径）植物，但其光合作用会随着环境条件的变化在CAM与C3途径间转换，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）作为C4植物和兼性景天酸代谢途径（CAM）植物光合碳代谢的源头关键酶，其活性的高低及基因表达量对光合速率及光合产物（多糖类物质）的积累有着至关重要的作用[3，9]。本研究以铁皮石斛试管苗为材料，对铁皮石斛在不同光质下叶片中多糖含量、PEPC活性和PEPC基因表达量变化趋势进行分析，为进一步探索铁皮石斛多糖代谢途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在白光（对照）、红光、蓝光和绿光4种不同光质下培养6个月的铁皮石斛试管苗（瓶苗），取2～5片成熟叶片用于试验。光照使用的各种光源均系冷光源，主要技术参数见表1。每天光照15 h，培养温度25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 不同光质对多糖含量的影响 采用苯酚-硫酸法[10]对不同光质条件下铁皮石斛叶片中多糖含量进行测定。绘制出葡萄糖标准曲线方程式为：

Y（μg）=144.85A-0.3061（R2=0.999 6）

式中V1為样品定容体积（mL）；V2为样品定容液取样体积（mL）；V3为沉淀定容体积（mL）；V4为测定用样液体积（mL）；W为样品重量（g）；Y为标准曲线查得样品溶液中葡萄糖含量（μg）。

1.2.2 不同光质对PEPC活性的影响 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是C4植物和CAM植物光合碳代谢的关键酶[9]，催化PEP与CO2形成草酰乙酸。PEPC不但在光合碳代谢中起着重要作用，同时也与其他代谢途径相偶联，如氮代谢、水分代谢等。因此在植物生理研究中，常需要测定其活性。

PEPC活性的测定参考“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性检测试剂盒”的操作手册进行。根据PEPC催化原理，通过测定340 nm下NADH的氧化率（即340 nm下吸光值的下降率）可计算出PEPC活性的大小。

将0.1 g叶片放入预冷的研钵中，加入少量石英砂，再加入1 mL预冷的提取缓冲液，迅速将其冰浴研磨成浆状，以4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，置冰上待测；按试剂盒中的测定步骤加入各试剂，充分混匀后于25 ℃水浴5 min；将试剂盒中各试剂按顺序加入石英比色皿中，以加蒸馏水为对照，加样的同时开始计时，混匀后分别在25 ℃、340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应5 min后的吸光度A2，计算二者差值（ΔA），ΔA=A1-A2。试验重复3次，再按下式计算PEPC活性。

PEPC活性（U/g）=1 624×（ΔA样本-ΔA对照）÷样品质量（g）。

1.2.3 不同光质对PEPC基因表达量的影响

（1）引物的设计。以18S rRNA为内参基因，利用已知的铁皮石斛PEPC基因（EC.4.1.1.31）序列设计定量PCR引物[11]（NCBI检索登录号为JF423930），设计过程按照标准荧光定量PCR引物设计原则进行，具体引物序列如表2所示。

（2）总RNA的提取和cDNA的合成。剪取不同光质处理下铁皮石斛成熟叶片各100 mg，参照TRIPURE试剂盒说明书，分别提取各样品总RNA；通过电泳检测其完整性，用紫外分光光度计检测RNA质量，选取OD260/280值在1.9～2.1的RNA，采用TAKARA公司的SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。

（3）实时荧光定量PCR。铁皮石斛PEPC基因在不同光质下的实时荧光定量PCR参考Lin等[12]的方法，试验重复3次。反应体系（共20 μL）：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上下游引物各0.4 μL，1 μL不同处理下的cDNA模板，用ddH2O补足至 20 μL；反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 不同光质对铁皮石斛叶片多糖含量的影响

从图1可以看出，在不同光质条件下培养6个月的铁皮石斛试管苗叶片中多糖含量百分比呈现出白光>红光>蓝光>绿光的趋势，且绿光条件下的多糖含量明显低于其它光质，这说明白光及红光对铁皮石斛多糖合成有促进作用，而绿光则有较大程度的抑制作用。

2.2 不同光质对铁皮石斛叶片PEPC活性的影响

铁皮石斛为CAM植物，随着环境条件的变化，其光合作用在CAM与C3途径间转换。图2表明，PEPC在铁皮石斛光合作用过程中起到了调节作用，其对光质处理较敏感。在铁皮石斛试管苗生长的第1个月，不同光质下PEPC活性没有明显差距；从第2个月起，不同光质下PEPC活性均有不同程度的提高，其中白光下PEPC活性最高，红光与蓝光持平，绿光最低；到第3个月时，PEPC活性均进入快速提升期，白光下提升速度最快，增幅达到130%，红光、蓝光持平，增幅为110%左右，绿光最慢，增幅只达45%；第4个月起，除绿光外，其它不同光质下PEPC活性均开始下降，白光下降最为缓慢，与第3个月相比，只有轻微的下降，但红光及蓝光有明显下降趋势，而绿光不降反升，原因可能与抗逆境胁迫有关；生长到第5个月，白光下PEPC活性也开始显著下降，红光与蓝光降幅增大，活性更低，绿光下PEPC活性还在缓慢上升，红光、蓝光和绿光三者的PEPC活性差距逐渐减小。

2.3 不同光质对铁皮石斛叶片PEPC基因表达量的影响

以白光处理下的铁皮石斛试管苗PEPC基因表达量为对照，计算不同光质下PEPC基因的相对表达量。由图3可以看出，PEPC在不同光质下均有表达，但表达量的高低有明显差异。相对于对照（白光），不同光质处理后叶片中PEPC基因的表达均有上调趋势，其中蓝光及红光下PEPC基因的上调表达较明显，而绿光下的表达量明显偏低。由此可见，红光、蓝光和绿光对PEPC基因的表达起正调控作用，其中蓝光及红光的调控作用更为明显。

2.4 不同光质下多糖含量、PEPC活性与基因表达量的比较

对铁皮石斛多糖含量、PEPC活性和PEPC基因表达量的变化趋势做了比较分析（图4），发现多糖含量和PEPC活性变化趋势是一致的，表现为白光>红光>蓝光>绿光，说明PEPC活性与多糖含量呈正相关，PEPC活性越强，CO2同化效率越大，获得的光合产物越多。而PEPC基因表达量与其它两者之间的变化趋势在红光、蓝光和绿光3种光质下是一致的，但在白光下则恰恰相反，表现为红光>蓝光>绿光>白光，白光下PEPC基因表达量是最低的。

3 讨论

3.1 PEPC酶活性越强，获得的光合产物越多

光质对植物生长的调节，大多与光质能影响光合作用相关酶的活性及基因表达有关。本试验所研究的PEPC酶催化C4和CAM代谢途径中的第一步反应，同时是光合作用源头关键酶，是一类高效特异性表达的酶类。叶片中高PEPC酶活性可以引起气孔保卫细胞中苹果酸浓度的升高，促进气孔的张开，从而具有较高的光合速率[13]。Jiao等[14]研究表明，PEPC活性高的水稻，其净光合效率也显著提高；何立斌等[15]发现水稻始穗期剑叶中的PEPC活性和净光合速率均较高。本研究中铁皮石斛多糖含量和PEPC活性变化趋势是一致的，表现为白光>红光>蓝光>绿光，也说明了PEPC活性越强，CO2同化效率越大，获得的光合产物越多。

3.2 PEPC酶活性的增加能提高植物抗逆能力

相對白光、红光和蓝光而言，绿光不在光合有效辐射波长范围内，会不同程度地抑制叶绿素的合成，是一种不利铁皮石斛生长、降低光合产物的逆境因子[10]。本研究中绿光下试管苗生长后期PEPC活性不仅不降反而大幅度增加，这与丁在松等[16]的研究结果一致，这可能是由于PEPC参与铁皮石斛的抗逆性反应，其活性的增加能提高植物体内抗氧化酶活性，保护植物免受伤害。

3.3 PEPC基因表达量与光合速率的表现并不一致

本研究结果发现PEPC在叶片中的表达会受到光质调节，白光下PEPC基因表达量最低，红光、蓝光及绿光下基因表达量均比白光高，但同时发现，基因表达量与酶活性之间没有必然的正相关，查阅资料也发现PEPC基因的高表达与高光合速率并非同步[17]。出现这种现象有2种可能：第一，红光、蓝光及绿光这3种光质能通过光敏色素提高PEPC中相关编码基因转录水平，但转录合成的多肽链在后期加工形成具有活性的酶的过程中，由于一些不定因素如基因过度表达产生过多的表达产物量对该酶活性起反馈抑制作用，从而出现酶活性下降的情况。第二，PEPC对植物光合代谢的调节过程往往与代谢产物的反馈调节作用相关。红光、蓝光及绿光下PEPC基因的高表达可能影响一些碳、氮代谢相关酶的活性，使部分碳转向氮代谢途径，从而改变光合产物的合成与转化[18]。丁在松[16]、罗遵喜[19]、Doubnerva等[20]在转基因植物研究中也发现，引起PEPC基因差异表达的因素除DNA甲基化和不同启动子等体内调节因子外，还受到光、温度、pH、氮代谢、盐及干旱等外界环境因子的影响，同时也依赖于器官或细胞的类型、发育时期以及叶片的位置[21-23]。具有高表达水平的PEPC作为外源基因被导入烟草、水稻等C3作物中后，并不能达到其可能的最高活性，PEPC基因高表达与高光合速率并非同步[24-26]。因此，PEPC的高表达能否作为植物高合光效率的关键指标尚存在争议。PEPC基因的作用机制、定位以及功能还有待于进一步研究。

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