基于核酸外切酶Ⅲ辅助双循环等温信号放大的高灵敏Hg2+传感方法研究

摘 要 设计了一种Hg2+触发的核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）辅助的双发夹探针双循环等温信号放大策略，在此基础上发展了一种免标记、超灵敏的Hg2+生物传感器。在Hg2+存在情况下，发夹探针1的3"游离序列与汞离子识别探针通过T- Hg2+-T配位结合形成双链DNA平末端，核酸外切酶Exo Ⅲ能识别双链DNA平末端并沿3"-5"方向催化水解茎部序列。释放的Hg2+和识别探针进入新一轮反应循环（循环1）;释放的发夹探针1未降解序列包含Ⅰ区序列和G-四链体形成序列，其中，Ⅰ区序列与发夹探针2的3"游离序列（Ⅰ区序列）完全互补，引发了Exo Ⅲ参与的双链DNA平末端水解，释放的Ⅰ区序列进入新一轮反应循环（循环2）。循环1和2为自发循环过程，经过多次循环可以产生大量单链的G-四链体序列。体系中加入氯化血红素，与G-四链体结合形成G-四链体-血红素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反應体系显色。考察了多种因素对检测体系的影响，在最优实验条件下，此方法对Hg2+的线性检测范围为0.3～50 pmol/L，检出限为0.25 pmol/L（S/N=3），回归方程为ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+ （pmol/L）。当水样中存在大量其它金属离子时，传感器对Hg2+仍然具有较高的选择性。将此方法应用于环境水体中Hg2+含量检测，加标回收率为96.0%～106.0%。本方法操作简单、选择性好、灵敏度高、有较强的抗干扰性能，可用于环境水样中Hg2+的高灵敏检测。

关键词 等温信号放大; 核酸外切酶Ⅲ; G-四链体-血红素DNA酶; 汞离子; 比色分析

1 引 言

汞具有非生物降解性和生物蓄积性等特性，即使在低浓度情况下，也能对人体健康造成毒害影响[1，2]，因此，汞污染一直是严重的环境问题。水溶性的二价汞离子（Hg2+）是汞最常见和最稳定的存在形式之一[3，4]，近年来，Hg2+污染日益严重，因此发展灵敏度高、选择性好、成本低、通用性强、操作简便的痕量Hg2+定量分析技术已经成为环境监测的中心任务之一。

目前，用于Hg2+检测的传统方法主要包括电感耦合等离子体质谱法[5]、原子吸收发射光谱法[6]、冷蒸气原子荧光光谱法[7]、电化学法等[8]，这些方法具有较好的特异性、准确性及灵敏度，但依赖精密仪器、操作过程复杂、成本较高等缺点，限制了其在现场检测的应用。近年的研究发现，胸腺嘧啶（T）与Hg2+之间能够通过NHg键形成T-Hg2+-T结构，并且T-Hg2+-T结构中的NHg键比Watson-Crick氢键更稳定[9]，由此可以实现Hg2+的高选择性识别。基于该结构，发展了许多Hg2+检测新技术，如荧光光度法[10]、电化学方法[11]、表面等离子体共振[12]、表面增强拉曼散射[13]和比色传感器[14，15]等，但这些方法的灵敏度普遍较低。为了解决Hg2+检测的灵敏度问题，缺刻核酸内切酶被用于辅助Hg2+循环利用信号放大。Hg2+的存在可以引发缺刻核酸内切酶对含有T-T错配的DNA二聚体的切割活性，DNA双链结构被核酸酶消化后，Hg2+从T-Hg2+-T结构中释放出来，并引发新一轮切割。因此，样品中包含的痕量Hg2+通过循环利用可以产生较高的响应信号[16，17]。但是，由于缺刻核酸内切酶的激活需要识别特定序列，导致Hg2+识别DNA探针的设计比较严苛，限制了该类技术的应用范围。

近年来，由于具有酶激活不依赖特定序列的识别及能够被T-Hg2+-T特异识别形成的3"平末端高效激活等优点，核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）被广泛应用于开发选择性好、灵敏度高的靶标循环利用信号放大新技术[18，19]。然而，近期发展的Exo Ⅲ辅助的Hg2+循环利用检测策略主要为Hg2+单循环利用技术。Ren等[20]设计了一种通过Hg2+引发末端结合并形成3"平末端的发夹DNA探针，在Exo Ⅲ辅助下，通过Hg2+循环利用放大信号，对水样中Hg2+检出限为10 pmol/L; Chen等发展了一种便携式试纸条生物传感器用于Hg2+的可视化检测，该方法通过T-Hg2+-T的特异性识别诱导双链核酸探针形成3"平末端，进而引发Exo Ⅲ辅助的Hg2+单循环利用信号放大，Hg2+检出限为1 pmol/L[21]。在此基础上，设计并构建Exo Ⅲ辅助的靶目标多重循环利用策略，可进一步提高Hg2+检测的灵敏度。

作为一种重要的酶促信号放大方法，DNA酶催化技术由于具有成本低、操作简单、检测快速等优点，在生物分析和生物传感领域引起了广泛关注[22]。具有类过氧化物酶活性的G-四链体-血红素DNA酶是近年来该领域研究的热点之一，已被广泛用于高灵敏传感器的构建，并用于病毒[23]、金属离子[24]、小分子[25]等的检测。

本研究利用Exo Ⅲ辅助的靶目标循环利用信号放大、Hg2+触发的核酸探针末端结合以及G-四链体-血红素DNA酶的催化信号放大的技术优势，设计并构建一种免标记、超灵敏的双发夹探针介导的双循环信号放大体系， 用于Hg2+比色传感。此体系整合3种信号放大技术：Exo Ⅲ辅助的Hg2+循环利用（循环1）、Exo Ⅲ辅助的Ⅰ区序列循环利用（循环2）以及基于DNA酶的催化信号放大。本方法具有简单方便、成本低、灵敏度高、特异性好等优点，可用于现场检测自来水、湖水、河水等水体中的Hg2+含量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）; 7700X型电感耦合等离子体质谱（安捷伦公司）; THZ-C-1 台式冷冻恒温摇床（太仓市实验设备厂）;  Milli-Q Reference 超纯水器（德国默克密理博公司）; 高速离心机（艾本德生命科学公司）; pH-2602 酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）; 电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）; DH300恒温金属浴（杭州瑞诚仪器有限公司）。

氯化血红素（Hemin）、2，2"-联氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二甲亚砜（DMSO）、HgCl2、Pb（NO）2、CdCl2、FeCl3及其它金属离子溶液均购自上海生工生物工程股份有限公司。所用试剂均为分析纯，且未经过进一步纯化。实验用水为超纯去离子水。

DNA探针由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列信息见表1。

2.2 实验方法

2.2.1 发夹探针的制备 发夹探针1、发夹探针2及汞离子识别探针用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4，包含70 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L KCl）配制。为了减少非发夹二聚体的产生，并提高发夹结构的形成比例，采用逐步缓慢退火方法。将发夹探针1（0.5 μmol/L）和發夹探针2（0.5 μmol/L）于冰上溶解，随后90℃孵育10 min，70℃孵育10 min，50℃孵育30 min，30℃孵育10 min，最后于室温放置30 min。

2.2.2 Hg2+比色分析 移取25 μL发夹探针1（0.5 μmol/L）、25 μL发夹探针2（0.5 μmol/L）和25 μL 汞离子识别探针（0.2 μmol/L）于灭菌离心管中，加入0.5 μL Exo Ⅲ （20 U/μL）和25 μL不同浓度的Hg2+溶液，25℃孵育60 min ，再加热到80℃，保温10 min，灭活Exo Ⅲ。加入0.5 μL 0.4 μmol/L Hemin，避光下37℃孵育60 min。移取10 μL上述溶液，加入45 μL ABTS（4 mmol/L）和45 μL H2O2 （4 mmol/L），37℃反应8 min。选择420 nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA420 nm=A420 nm-A0，其中，A420 nm为样品测量值，A0为Hg2+浓度为0时的背景值。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

本研究设计了2个具有特定序列的发夹探针，借助T-Hg2+-T结构形成的特异性、Exo Ⅲ辅助的靶目标循环利用以及G-四链体-血红素DNA酶的催化信号放大性能，构建了一种基于Hg2+引发和Exo Ⅲ辅助的靶目标双循环回收利用信号放大技术，用于Hg2+比色传感。G-四链体的形成至少需要4组连续或相互靠近的GGG序列，发夹探针1和发夹探针2的序列都含有4组GGG重复序列，但由于2个探针在形成茎环结构时都有2组GGG被包含在茎部区域，因此不能形成分子内G-四链体。如图1所示，在发夹探针1、发夹探针2、汞离子识别探针及Hg2+存在时，汞离子识别探针的5"端序列与发夹探针1的3"末端单链游离序列（富含T碱基）通过形成2个T-Hg2+-T特异性配位结构相互杂交，并在发夹探针1的3"末端形成了双链DNA平齐末端，此时，汞离子识别探针的3"端设计为游离末端，不能被Exo Ⅲ切割。 在这种情况下，Exo Ⅲ能识别双链DNA平末端并沿3"- 5"方向催化水解发夹探针1的茎部序列，释放出单核苷酸、Hg2+、汞离子识别探针及发夹探针1未降解序列。释放的Hg2+和汞离子识别探针可引发新一轮发夹探针1的Exo Ⅲ切割反应，由此形成反应循环（循环1）; 释放的发夹探针1未降解序列中包含的5"茎部序列（Ⅰ区序列），可与发夹探针2的3"末端单链游离序列（Ⅰ区序列）完全互补，形成双链DNA平齐末端，引发Exo Ⅲ参与的双链DNA平末端切割，水解发夹探针2的茎部序列，释放出Ⅰ区序列进入新一轮反应循环（循环2）。循环1和2为自发循环过程，经过多次循环可以产生大量单链的G-四链体序列。在体系中加入氯化血红素，与G-四链体结合形成G-四链体-血红素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反应体系显色。由于G-四链体-血红素-DNA酶的量与吸光度呈正相关，设计的Exo Ⅲ辅助双循环靶标回收利用策略能够显著放大检测信号。

3.2 实验条件的优化

考察了影响双发夹探针双循环等温信号放大系统分析性能的实验条件对检测的影响，包括T-T错配数目、Exo Ⅲ催化反应温度及时间、Exo Ⅲ浓度。

3.2.1 T-T错配数目的选择 发夹探针1的3"端游离序列与汞离子识别探针之间可通过T-Hg2+-T错配互补结合，其T-T错配数目对Hg2+检测系统的性能非常重要。设计了4种汞离子识别探针，分别能够形成1～4个T-T错配。结果如图2A所示，在Hg2+存在情况下，末端存在2个T-T错配的识别体系表现出较高的吸光值。因此，后续选择汞离子识别探针2，在Hg2+存在时，此探针能够高效诱导双链平末端形成，并激活Exo Ⅲ辅助的双循环目标再利用信号放大，用于Hg2+含量分析。

3.2.2 Exo Ⅲ催化反应温度的选择 考察了不同的Exo Ⅲ反应温度（10～35 ℃）对Hg2+比色传感体系信号的影响。如图2B所示，在10～25℃范围内，随着反应温度升高，反应体系ΔA420 nm增加; 但在25～35℃范围内，随着温度升高，吸光值反而降低。这是由于反应温度较高时，汞离子识别探针较短，不能稳定地与发夹探针1的3"游离序列杂交，Exo Ⅲ与之结合不稳定，导致催化活性降低; 另外，反应温度较高时，发夹探针1和2的茎部序列结合不稳定，直接打开后可形成分子内G-四链体，背景信号升高 （在没有Hg2+的情况下）。为了获得最佳检测信号（ΔA420 nm），后续实验的反应温度采用25℃。

3.2.3 Exo Ⅲ催化反应时间的选择 Exo Ⅲ的催化反应时间对信号放大有较大影响。如图2C所示，随着反应时间延长，ΔA420 nm不断增加，孵育60 min后，信号达到稳定，随后开始下降，这主要是背景信号逐渐升高导致的。因此，催化反应时间选择60 min。

3.2.4 Exo Ⅲ浓度的选择 Exo Ⅲ的工作浓度对于信号放大系统非常关键。体系响应信号随Exo Ⅲ浓度的增加而增大，在10 U Exo Ⅲ时达到最大值; 随着Exo Ⅲ浓度进一步升高，响应信号反而下降。这是由于反应体系中无论Hg2+是否存在，高浓度的Exo Ⅲ会不可控地切割DNA探针，从而导致背景信号升高。因此，Exo Ⅲ的最佳工作浓度为10 U。

综上，选择Hg2+引发的末端结合位点存在2个T-T错配位点、Exo Ⅲ催化温度25℃、Exo Ⅲ孵育时间60 min和10 U 的Exo Ⅲ工作浓度为最佳实验条件。

3.3 Hg2+的选择性分析

考察了不同离子（Zn2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+）对检测体系响应信号的影响。结果如图3所示，在最优实验条件下，空白對照（未加入任何干扰离子）的吸光值与分别加入单一不同种类干扰离子的反应体系吸光值相近（黑色柱状图），说明以上离子对此传感体系无显著影响; 考察了Hg2+与其它金属离子共存时的信号值变化情况，向反应体系中同时加入100 pmol/L的Hg2+和上述10 nmol/L干扰离子，结果显示，各共存反应体系的吸光值与空白对照吸光值相差不大（白色柱状图），相对误差在1.5%～3.1%之间，证明以上几种金属离子对Hg2+检测的干扰很小，设计的生物传感器对Hg2+具有高的选择性。

3.4 Hg2+的定量检测

在最优实验条件下，采用本方法测定了不同浓度的Hg2+标准液的响应信号。由图4A可知，随着Hg2+浓度的增大，反应体系在420 nm的吸光值不断升高，。Hg2+浓度在0.3～50 pmol/L之间呈现良好的线性关系（图4B），回归方程为ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+（R2=0.992）， 检出限为0.25 pmol/L（3σ），远低于我国《生活饮用水卫生标准》规定的饮用水中无机Hg2+的最高允许水平（<5 nmol/L，1 ppb）。

结果表明，本方法对Hg2+的定量分析具有较高的灵敏度和良好的线性度。

早期传统的比色传感系统由于缺乏有效的信号放大方法，只能识别nmol/L级的Hg2+ [15，26]。近年来建立的DNA探针介导Exo Ⅲ辅助的单循环靶标（Hg2+）回收利用策略，可以实现pmol/L水平的Hg2+检测 [20，21]，上述方法仅仅使用了一个信号放大循环（Exo Ⅲ辅助Hg2+循环利用）。与现有的Hg2+含量分析方法相比（表2），本方法具有良好的检测性能，这主要归因于三重信号提升方式： Exo Ⅲ辅助Hg2+循环利用、Exo Ⅲ辅助Ⅰ区序列循环利用以及G-四链体-血红素DNA酶的酶促催化信号放大。

3.5 实际样品分析

分别采集湘江水、自来水以及湖水样品，使用前过滤去除悬浮颗粒及杂质。各样品中分别添加0.5、 5.0、 50.0和100.0 pmol/L Hg2+。采用本方法进行测定，检测结果如表3所示，3种不同来源水体样品的加标回收率在96.0%～106.0%之间。采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定了水体样品中的Hg2+浓度，使用的ICP-MS方法由于灵敏度的限制，能够准确定量的Hg2+添加浓度为50.0 pmol/L和100.0 pmol/L，其结果与本方法检测结果的相对误差为5.3%～6.0%。结果表明， ICP-MS测定值与本方法的测定值没有显著差异，说明本方法具有良好的准确度和灵敏度，能够满足环境水体中 Hg2+检测的要求。

4 结 论

基于Hg2+触发的核酸探针末端结合、核酸外切酶Ⅲ辅助的靶目标双循环再利用信号放大以及G-四链体-血红素DNA酶酶促催化信号放大，设计并构建了一种免标记、超灵敏的双发夹探针介导的靶目标双循环等温信号放大新技术， 用于Hg2+的比色传感。本方法操作简单、灵敏度高、特异性好，对环境水体样品具有良好的检测性能，可用于环境检测领域现场分析技术的开发。

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