莲藕贮藏期主要致病真菌分离鉴定及其致病相关酶酶学特性研究

摘要：分别用组织分离法、直接挑取法和组织浸液划线法对贮藏期患病莲藕的病原菌进行分离，分离得到9种真菌，经回接发现9种真菌均致病。再通过形态学鉴定，初步确定9种真菌中有3种分别属于青霉属（Penicillium）、交链孢霉属（Alternaria）和芽枝孢霉属（Cladosporium），其他6种属于镰刀菌属（Fusarium），其中1株可产生红色素的镰刀菌的致病能力最强。选择产红色素的致病性最强的镰刀菌，通过测定活体外和活体内的聚甲基半乳糖醛酸酶（PGM）和羧甲基纤维素酶（Cx）2种细胞壁降解酶活性的变化研究该病原菌的致病机理，结果显示，在活体外，PMG的活性随着培养时间延长先增加后降低最后到基本不变，而Cx活性则持续缓慢增加，即在前期主要是PMG起作用，后期则主要是Cx起作用；在活体内，接菌的莲藕的PMG和Cx活性显著高于未接菌的藕（P＜0.05），说明PGM和Cx这2种细胞壁降解酶在病原菌的致病过程中起到了重要作用，是重要的致病因子。

关键词：莲藕；腐烂；病原菌；镰刀菌属；聚甲基半乳糖醛酸酶；羧甲基纤维素酶

莲藕是集果、蔬、药为一体的优质蔬菜，具有很高的营养价值、药用价值和经济价值。除鲜食外，还可作藕粉、莲藕汁饮料、速冻藕片、脱水藕片、清水藕、盐水藕、藕脯等加工制品[1]。近年来莲藕的种植面积逐步增大，并以水煮藕、盐渍藕、速冻藕和真空保鲜藕等形式出口到美国、日本和新加坡等国家[2]。但是莲藕采挖后，暴露于空气中易出现褐变、干缩、霉烂等现象，制约了莲藕贮藏、运输及出口销售产业的发展。目前针对莲藕已经开发出了系列抗褐变剂，结合涂膜、真空、低温等保鲜技术可以较好地控制褐变，然而在低温贮藏过程中霉变依然严重影响贮藏鲜藕的商品性。因此本研究对低温贮藏条件下霉变的莲藕，分离鉴定引起贮藏莲藕霉变的主要病原微生物，从酶学角度分析主要致病菌的致病机理，为低温贮藏条件下保持莲藕的新鲜度和品质提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料取自2010年5～6月贮藏于4～10℃条件下，有典型的发霉或腐烂症状的莲藕；人工回接莲藕购于华中农业大学菜市场，品种皆为鄂莲5号（品种代号：3735）。CM304冻干血浆为北京陆桥技术有限责任公司生产。氧化酶试剂由法国biosMerieumx生产。

1.2主要培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL[3]。

1.3真菌的分离纯化

为抑制细菌污染，先在200 mL PDA培养基中加入1 mL经过滤除菌的100 mg/mL的头孢霉素和2～3滴25%的乳酸，再倒平板。然后采用以下2种方法进行分离：①直接挑取霉菌菌丝接种到平板上，25℃倒置培养；②切取病健交界处组织，先用升汞消毒2～3 s，再用75%酒精消毒2 min，然后用无菌水冲洗，置于平板上，25℃倒置培养。待菌丝长出时，挑取菌丝移至另一平板培养，重复2～3次确保菌种纯化，然后于4℃斜面保藏备用。

1.4致病性检测

取PDA平板上培养5～6 d的新鲜菌体，用直径为6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌碟进行回接。将藕表面清洗干净，用75%酒精擦拭消毒，并用无菌水冲洗3次，无菌操作台上晾干。将以上制备的菌碟和菌液分别采用“刺伤”和“无伤”2种方式进行接种，每6个藕为1组，并以无菌水涂抹处理为对照。接种后将藕置于铺有1层打湿的吸水纸的保鲜盒中，保鲜膜封口并用橡皮筋扎住周围，置于4～10℃冰箱。待莲藕发病后，对发病莲藕进行病原菌的再分离。

1.5病原真菌的鉴定

采用形态学方法鉴定。取灭菌的盖玻片斜插在PDA平板上，再接上纯化的菌种，25℃培养3～4 d。然后拔出盖玻片，置于载玻片上于显微镜下观察菌丝及孢子形态，记录观察结果并拍照，菌丝体或孢子无色的菌先用棉蓝进行染色，再拍照。根据菌落、孢子及孢子梗形态，参考《真菌鉴定手册》[4]、《真菌学》[5]、《普通真菌学》[6]等将其鉴定到属。

1.6细胞壁降解酶的提取

①活体外病原菌细胞壁降解酶的培养及提取参考薛莲等[7]和冯晶等[8]的方法，向改良的Czaper液体培养基中加入果胶或羧甲基纤维素钠（CMC）作为碳源（果胶诱导产生果胶酶，CMC诱导产生纤维素酶），后分装于250 mL三角瓶中，每瓶装100 mL培养基。病菌在25℃培养5 d，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，每瓶培养基中加入3片菌碟，25℃振荡培养，过滤除去菌丝，4℃下10 000 r/min离心25 min，取上清液作为待测酶液。

②采用乙醇—NaCl提取法提取病原菌感染后活体内细胞壁降解酶[7，10]。

1.7细胞壁降解酶活性的测定

聚甲基半乳糖醛酸酶（PGM）活性和羧甲基纤维素酶（Cx）活性均采用分光光度计法测定[9，10]。酶活单位为50℃下每1 min催化底物释放1 μg还原糖所需酶量，酶活单位（U/g）= m×1 000/（30×0.5）。

1.8数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2003软件分析数据、绘制图表。用SPSS 11.5进行方差（ANOVA）分析，用最小显著差法（LSD）与S-N-K检验法进行多重比较。

2结果与分析

2.1莲藕贮藏期的发病症状

贮藏2周后莲藕开始发病，表皮擦伤处和藕节处最先开始发粘，其后莲藕表面擦伤处出现比较干燥的粉红色粉末状菌落，其颜色逐渐变褐变黑，表面出现青色、灰色和白色霉菌（图1b），贮藏中后期发病严重的藕会出现腐烂现象（图1c），且黑色面积扩大，藕也出现严重皱缩。

2.2分离的致病真菌

从9株发病较典型的病株上分离到60株霉菌，根据PDA平板上菌落的形态、颜色将霉菌归为9种，真菌在PDA平板上的菌落形态见图2。

2.3人工回接试验

由试验结果可知，9种霉菌回接后均可引起莲藕发病，各菌主要通过伤口侵入，且侵入后发病率均较高。M4、M5、M8、M9这4种菌在莲藕无伤的条件下也可使其发病，M4与M5的无伤发病率分别可达到60%，50%，此外，M4、M5有伤接种后的发病程度最严重，其中M4的发病率略高于M5。由此判断，莲藕贮藏期主要病原菌为霉菌，且M4的致病能力最强。

2.4病原真菌鉴定

M1菌丝无色或淡色，有横隔，分生孢子梗顶端有特殊的扫帚状分支，分支为多极的分生孢子梗，最后产生许多瓶梗，瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子呈球形，鉴定其属青霉属（Penicillium）。M2菌丝淡褐色，有隔膜，分生孢子梗较短，单生，不分枝，分生孢子深褐色，串生有分枝，呈纺锤状或倒棒状，顶端延长成喙状，多细胞，有砖壁状分隔，横隔1～4个，纵隔0～3个，鉴定其属交链孢霉属（Alternaria）。M3分生孢子梗淡褐色，单生，有分支，分生孢子褐色，卵形至椭圆形，有链状分支，鉴定其属芽枝孢霉属（Cladosporium），各菌孢子及孢子梗形态见图3。M4、M5、M6、M7、M8、M9菌丝有隔，分枝，分生孢子为小型或大型，小型分生孢子卵圆形至柱形，有1～2个隔膜，大型分生孢子镰刀形或长柱形，有较多隔膜，鉴定其属镰刀菌属（Fusarium）。其中M4产红色素，M5产黄色素，各菌孢子形态见图4。

2.5病原菌M4活体外细胞壁降解酶酶活的变化

由图5可以看出，在离体条件下，聚甲基半乳糖醛酸酶的活性先迅速增大再降低，最后基本保持不变。第2天，其活性达到最大，之后则不断下降，第5天开始基本不变，说明在培养基中以果胶作为碳源时，M4在前2 d可迅速产生聚甲基半乳糖醛酸酶，之后则可能由于果胶不断被分解消耗或pH值不断下降而导致聚甲基半乳糖醛酸酶活性下降。纤维素酶活随着培养时间延长而不断增加，与聚甲基半乳糖醛酸酶活相比，其增加速度比较缓慢。综合得出，在诱导物存在的条件下，莲藕贮藏期的病原菌具有产生聚甲基半乳糖醛酸酶和纤维素酶的能力。在病原菌培养过程中，细胞壁降解酶可持续产生，前期主要是PMG 起作用，后期主要是Cx起作用。

2.6病原菌活体内细胞壁降解酶的活性

活体内的细胞壁降解酶是在莲藕接上致病菌后第21天进行测定的。由图6可以看出，接有菌的莲藕其聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纤维素酶（Cx）的活性分别为2.64，4.74 U/g，而未接菌的莲藕其聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纤维素酶（Cx）的活性分别为1.83，3.45 U/g。经T检验分析，接菌的莲藕与未接菌的莲藕相比较，其两种酶活的差异均具有显著性（P＜0.05）。由于病原菌侵染前期主要是果胶酶破坏胞间果胶物质，此阶段的果胶酶作用比纤维素酶大，在病原菌侵染后期，主要由纤维素酶降解细胞壁物质[11]，因此在病菌侵染后其纤维素酶活会大于果胶酶酶活。

3结论与讨论

目前，关于莲藕的研究主要集中在防褐变、产品工艺及多酚氧化酶、膳食纤维、酚类物质、淀粉等成分的提取、结构及功效研究方面；病害方面的研究主要是田间植株的腐败病，包括病原菌的分离鉴定及其发病规律与防治的研究，各研究认为莲藕腐败病病原菌主要为尖镰孢菌莲专化型（F. oxysporum f. sp. nelumbicola）[12~14]，其次为串珠镰孢菌、腐皮镰孢菌、接骨木镰孢菌、周毛杆菌等[15]。其中，Chen等[16]将分离到的尖镰孢菌莲专化型（F. oxysporum f. sp. nelumbicola）人工接种到莲藕上可引起莲藕褐色坏疽。而对于莲藕采后运输贮藏期微生物病害方面的研究尚属空白。

本研究选用湖北武汉地区的莲藕品种鄂莲5号（代号：3735）进行试验，从病株中分离到9种霉菌，并依照柯赫氏法则证明9种霉菌均可致病，引起莲藕发霉、变褐变黑及腐烂。通过形态学进一步鉴定，初步确定9种菌有3种分别属于青霉属（Penicillium）、交链孢霉属（Alternaria）和芽枝孢霉属（Cladosporium），其他6种属于镰刀菌属（Fusarium），其中1株可产生红色素的镰刀菌，其致病能力最强。

由以上结果可知，镰刀菌（Fusarium）为莲藕贮藏期的优势病原菌，但对于这些镰刀菌是否和前人研究的莲藕腐败病病原镰刀菌一致，仍需要进一步的鉴定来确认，以为莲藕低温贮藏时的霉变腐烂控制提供理论基础。

病原真菌在与植物长期进化和复杂的互作过程中，逐渐形成了对植物的寄生性和致病性。在环境条件适宜时，病原菌对寄主植物致病能力的大小取决于其所具有致病因子的多少和活性的大小，致病因子是病原真菌产生的对寄主植物有毒性的代谢产物，主要包括酶、毒素、激素及胞外多糖等其他致病物质[17]。病原菌在寄生过程中产生的胞外酶有非常重要的作用，其中与致病性有关的酶是细胞壁降解酶。本试验研究了聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纤维素酶（Cx）的致病作用，结果表明，在活体外，PMG活性随着培养时间延长先增加后降低最后到基本不变，而Cx活性则缓慢持续增加，即在前期主要是PMG起作用，后期则主要是Cx起作用；在活体内，接菌的莲藕PMG和Cx活性显著高于未接菌的藕（P＜0.05）。

在未接菌的莲藕上，PMG和Cx皆有活性，但并未引起病变。这是因为：一方面，植物体内的酶活必须超过一个阈值，才会引起病变，而健康的藕上所产生的PMG和Cx活性太低；另一方面，健康组织内的小环境不利于自身的细胞壁降解酶产生致病作用，只有在病菌侵入后，各种细胞壁降解酶相互协调，才能发挥浸解的作用，引起病变[8]。

病原菌对植物的致病因子除了酶，还有毒素、激素等物质，且活体外和活体内的环境因素不同，病原菌在培养基上产生的酶可能和被侵染的寄主组织上的酶不一样[18]，因此，关于莲藕贮藏期病原菌的致病机理仍需进一步研究。

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Research on Isolation and Identification of Pathogens from Lotus Root during Storage and Properties of Pathogenic-related Enzymes

LUO Haili, LI Jie, YAN Shoulei, WANG Qingzhang

( College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070 )

Abstract: The pathogens of lotus root diseases during storage were isolated and identified. The results showed that there were 9 fungi. Artificial inoculation test indicated that the 9 fungi had pathogenicity. According to morphological characteristics, three fungi were identified as Penicillium, Alternaria and Cladosporium respectively, the other six were defined as Fusarium, and one strain of the Fusarium producing haematochrome has the strongest pathogenicity. The Fusarium strain producing haematochrome and having the strongest pathogenicity was evaluated the pathogenic mechanism by determination of PGM and Cx activity, the results showed that in vitro, PMG activity was increased initially and then stepped down, and Cx activity increased in the period, which indicated that PMG mainly took effect at the previous period and Cx played an important role at the later stage. In vivo, PMG and Cx activities of lotus root inoculated pathogenic fungus were higher than the control (p＜0.05). Cell wall degrading enzyme played a significant role in the period of pathogen causing disease, and which was an important pathogenic factor.

Key words: Lotus; Rot; Pathogen; Fusarium; PMG; Cx