中温木聚糖酶高产真菌菌株筛选及产酶条件

摘要：利用以木聚糖作为惟一碳源的基础盐培养基，在３０℃培养条件下，从新乡周边土样及腐殖质中筛选到１株β－木聚糖酶高产真菌菌株（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８）。该菌株在２０～４０ ℃生长良好，最适生长温度３０ ℃。产酶培养条件优化结果表明，在培养温度为３０ ℃，培养基初始ｐＨ ６．０，以玉米芯为碳源，以蛋白胨、酵母粉和玉米浆为有机氮源，发酵４ ｄ，木聚糖酶活性达５６２．６ Ｕ／ｍＬ，木聚糖酶最适ｐＨ和温度分别为６．５和４０ ℃。

关键词：中温木聚糖酶；真菌；筛选菌株；产酶条件

中图分类号：ＴＱ９２０．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3475-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｅｒａｔｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ β－Ｘｙｌａｎａｓｅ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｕｎｇｉ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ＨＵＡ Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｉａ，ＪＩＡＯ Ｌｉｎｇ－ｘｉａｂ，ＹＵ Ｊｉａｎｇ－ａｏａ

（ａ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｂ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Fｏｏｄ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ β－ｘｙｌａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｉ， Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８， ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｈｕｍｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｘｉｎｘｉａｎｇ ａｔ ３０ ℃ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｘｙｌａｎ ａｓ the ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＦＬＨ２８ ｗａｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｉｎｇ ｗｅｌｌ ａｔ ２０～４０ ℃； ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ， ６．０； ｃｏｒｎｃｏｂ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ； ｐｅｐｔｏｎｅ， ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ａｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ； ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ for ４ ｄ ａｔ ３０ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs， ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ to ５６２．６ Ｕ／ｍＬ． Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｘｙｌａｎａｓｅ ｗａｓ ６．５ ａｎｄ ４０ ℃ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｘｙｌａｎａｓｅ； ｆｕｎｇｉ strain（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８）； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

木聚糖是植物细胞主要结构性多糖，主链由多个β－Ｄ－吡喃木糖基通过β－１，４－糖苷键连接的复杂分子多聚糖，主链连有各种取代基，分子中含有许多葡萄糖醛酸、乙酰基、阿拉伯糖、阿魏酸、香豆酸等侧链基团［１］。木聚糖是自然界含量仅次于纤维素的第二大类多糖，是半纤维素中含量最丰富的一种组分，占地球可再生有机碳的１／３［２］。它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面，进而影响动物的消化吸收，降低了饲料的营养价值。木聚糖酶（Ｘｙｌａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．８）主要以内切方式作用于木聚糖主链上的β－１，４－糖苷键，水解生成以木二糖为主的低聚糖［３］，它在生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用［４］，具有很大的商业开发价值。迄今为止，关于产无纤维素酶活性木聚糖酶的菌株报道很多，包括细菌、真菌和放线菌，其中曲霉属和芽孢杆菌属种类最多［５－８］。

目前，关于耐高温木聚糖酶菌株的筛选是木聚糖酶研究的一个热点，耐高温木聚糖酶对于工业生产木糖高温快速反应及饲料用酶制粒过程的酶活损失有一定的优点，但在３７ ℃左右普遍存在酶活较低的问题，对于一些瘤胃动物来说，其最适作用ｐＨ往往偏离中性的范围，不利于在饲料中的应用。因此，筛选中温、最适ｐＨ中性且在一定范围内有良好热稳定性的产木聚糖酶菌株对于木聚糖酶在饲料中的应用具有重要的作用。目前人们研究较多的真菌主要包括木霉、毛霉和曲霉等，关于镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌种产木聚糖酶的研究很少，且产酶水平较低，在３０ Ｕ／ｍＬ以下［９－１２］。试验筛选得到１株高产木聚糖酶菌株Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８，并对其产酶条件进行了初步研究。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 样品采集 样品采集于河南新乡周边土壤及太行山南麓丛林土壤及腐殖质中。

１．１．２ 培养基

１）筛选培养基（ｇ／Ｌ）：ＮＨ４Ｃｌ １．０，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０，ＫＨ２ＰＯ４ ０．１，ＣａＣｌ２ ０．４，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１，玉米芯木聚糖１．０，琼脂粉１５.0，用ＨＣｌ调ｐＨ 至５．５。

２）分离培养基：ＰＤＡ培养基［１３］。

３）发酵基础盐培养基（ｇ／Ｌ）：ＫＨ２ＰＯ４ １．０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３，ＣａＣｌ２ ０．４，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１。

１．１．３ 试剂 酵母提取物、胰蛋白胨（Ｏｘｏｉｄ）；榉木木聚糖、地衣多糖、昆布多糖、微晶纤维素（Ａｖｉｃｅｌ）、 ＣＭＣ－Ｎａ、木糖（Ｓｉｇｍａ）；标准低相对分子质量蛋白质（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）；玉米芯木聚糖（自制）；其他试剂均为分析纯。

１．２ 试验方法

１．２．１ 产木聚糖酶菌株分离 分别取土样及腐殖质１ ｇ左右，加入装有灭菌的１０ ｍＬ ０．９％的ＮａＣｌ溶液的小三角瓶中，室温振荡３０ ｍｉｎ，取０．１ ｍＬ 涂布筛选平板，倒置，于３０ ℃培养３～５ ｄ。用灭菌牙签挑取单菌落菌丝，转接于ＰＤＡ分离培养基进行单菌落分离。

１．２．２ 产木聚糖酶菌株复筛 用接种铲取面积约１ ｃｍ２ 的菌块，接种于含有蛋白胨１０ ｇ／Ｌ、酵母粉１０ ｇ／Ｌ和大麦粉２０ ｇ／Ｌ的发酵培养基上，１８０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ℃培养３～5 ｄ。取发酵液１ ｍＬ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清液测定酶活性。

１．２．３ 木聚糖酶活性测定 取１．０ ｍＬ底物溶液与经适当稀释的酶液０．１ ｍＬ混合，反应１０ ｍｉｎ后，沸水煮５ ｍｉｎ中止反应，以木糖等作标准，酶活性通过ＤＮＳ法测定还原糖含量得出［１４］。酶活性单位的定义为：４０ ℃、ｐＨ ６．５的磷酸缓冲液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）及底物浓度为１0 g/L条件下，每分钟生成１ μｍｏｌ还原糖所需要的酶量为１个酶活性单位。

１．２．４ 菌种初步鉴定 肉眼观察菌落形态和颜色等，石炭酸－棉蓝染色，显微镜观察菌丝、分生孢子梗及孢子形态。

１．２．５ 木聚糖酶酶谱分析 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳［１５］中加入０．１％木聚糖，电泳完毕，２０％异丙醇复性３次，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ６．５的磷酸缓冲液浸泡３次，每次１０ ｍｉｎ，直到紫外下显示透明条带。

１．２．６ 产木聚糖酶条件优化 ３０ ℃生长４ ｄ的菌落制成孢子悬液（１０８个／ｍＬ），接种添加各种氮源和碳源的基础盐培养基，５００ ｍＬ三角瓶装量２５ ｍＬ。考查不同条件对产酶的影响，试验结果为３次平行试验的平均值。

１．２．７ 产木聚糖酶最适ｐＨ和最适温度确定 ４０ ℃下，分别测定重组酶在ｐＨ ２．５～１１．０的４种不同缓冲液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，柠檬酸缓冲液ｐＨ ２．５～５．５，ＭＥＳ缓冲液ｐＨ ５．０～７．０，磷酸缓冲液ｐＨ ６．０～８．５，甘氨酸－ＮａＯＨ缓冲液ｐＨ ８．５～１１．０）中的相对酶活性，以最高酶活性为１００％；分别于２０～９０ ℃测定相对酶活性，以最高酶活性为１００％。结果为３次试验数据的平均值。

２ 结果与分析

２．１ 产木聚糖酶菌株筛选结果

经含单一碳源的木聚糖筛选平板和３０ ℃筛选，共筛选得到产木聚糖酶真菌菌株２４株，经摇瓶发酵和酶活性测定，发现1株真菌产酶活性较高，为４２４．２ Ｕ／ｍＬ。该菌株在２０～４０ ℃范围内生长良好，最适生长温度３０ ℃左右。ＰＤＡ培养基３０ ℃培养４ ｄ的单菌落呈突起絮状，菌丝白色疏松（图１ａ），背面呈浅褐色（图１ｂ）。

石炭酸－棉蓝染色的菌丝分枝有隔；分生孢子梗单生，散生于气生菌丝上，产生大型分生孢子，镰刀形（图２）。因此，根据菌落外观形态、颜色，孢子和孢子梗形态［１６］，初步鉴定该菌株为镰刀菌属，菌株命名为Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８。

２．２ 木聚糖酶酶谱分析结果

为考查镰刀菌ＦＬＨ28是否产多个木聚糖酶，取粗酶液进行木聚糖酶的酶谱分析。结果显示，酶谱只有一条透明带（图３），相对分子质量约为２２ ６00，和多数产木聚糖酶真菌１１家族相似。

２．３ 镰刀菌ＦＬＨ２８产木聚糖酶条件优化结果

２．３．１ 不同碳源对产木聚糖酶的影响 在含有蛋白胨和酵母粉各１０ ｇ／Ｌ的基础盐培养基中，分别添加２０ ｇ／Ｌ的经粉碎过６０目筛的玉米芯、玉米秆、大麦麸皮、稻草粉、米糠和甘蔗渣５种碳源进行产酶试验，１８０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ℃培养４ ｄ，结果（图４）显示，以玉米芯和玉米秆作碳源时产酶效果较好，其中以玉米芯为碳源时木聚糖酶活性可达４２６．８ Ｕ／ｍＬ。因此选用玉米芯为碳源进行后续产酶试验。

２．３．２ 碳源添加量对产木聚糖酶的影响 于含有蛋白胨和酵母粉各１０ ｇ／Ｌ的基础盐培养基中，分别添加不同量玉米芯进行产木聚糖酶试验，结果表明，在玉米芯添加量为５０ ｇ／Ｌ时，酶活性最高（图５）。随玉米芯含量的增加，酶活性反而有下降的趋势，可能是含量过高的玉米芯影响培养基的流动性，降低氧传递速率所致。

２．３．３ 氮源对产木聚糖酶的影响 通过添加不同种类和数量的氮源进行试验，３０ ℃培养４ ｄ，测定发酵液酶活性，确定产酶的最佳氮源。结果（表１）表明，以复合氮源豆粕粉＋玉米浆及酵母粉＋蛋白胨＋玉米浆较好，酶活性分别为４７３．６和４８２．５ Ｕ／ｍＬ，即添加玉米浆的复合氮源对木聚糖酶的产生具有较强的促进作用，可能是由于玉米浆中营养成分全面所致，具体原因有待进一步分析。考虑到工业应用成本，后续试验采用复合氮源豆粕粉＋玉米浆。

２．３．４ 培养基起始ｐＨ对产木聚糖酶的影响 以ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４缓冲体系配制浓度为１００ ｍｍｏｌ／Ｌ、不同ｐＨ（４．０～８．０）的培养基，接种等量的孢子悬浮液，３０ ℃培养４ ｄ，测定酶活性。结果（图６）显示，培养基起始ｐＨ对菌株产酶有明显的影响，最适产酶培养基起始ｐＨ ６．０左右，在ｐＨ低于５．０及ｐＨ高于７．０时，酶活性显著下降。

２．３．５ 培养温度对产木聚糖酶的影响 接种后的培养液分别于２０～４５°Ｃ培养４ ｄ后，取发酵液测定酶活性，结果见图7。由图7可见，培养温度对产酶有显著影响，产酶最适培养温度为３０ ℃左右，当培养温度高于４０ ℃，菌体生物量显著下降，同时，酶活性也显著降低。

２．３．６ 培养时间对产木聚糖酶的影响 在上述优化条件下，分别培养不同时间，从２４ ｈ开始，每隔１２ ｈ取样分析酶活性。结果（图8）表明，在培养１２０ ｈ时，酶活性最高，达５６２．６ Ｕ／ｍＬ，随后酶活性出现缓慢下降，在１５６ ｈ发现菌丝有自溶现象，但没有出现酶活性快速下降趋势，可能与木聚糖酶对蛋白酶的敏感性低有关。

２．４ FLH28所产木聚糖酶最适ｐＨ和最适温度

镰刀菌ＦＬＨ２８所产木聚糖酶最适ｐＨ约６．５（图9ａ），在ｐＨ ５．０～８．０时相对酶活性可达８０％以上。最适作用温度约４０ ℃（图9ｂ），高于７０ ℃，相对酶活性显著降低，在３０～５０ ℃时相对酶活性可达８５％以上，表明该木聚糖酶有较宽的ｐＨ和温度作用范围。

３ 结论

从新乡周边土样及腐殖质中筛选得到１株高产木聚糖酶真菌菌株，经对菌落形态特征及分生孢子梗和分生孢子形态的显微观察，初步鉴定为镰刀菌属菌株命名为Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８，其最适生长温度３０ ℃，在２０～４０ ℃时，生长良好。在培养温度为３０ ℃，培养基初始ｐＨ ６．０，以玉米芯为碳源，以豆粕粉+玉米浆为氮源，发酵５ ｄ，木聚糖酶活性达５６２．６ Ｕ／ｍＬ。

真菌来源木聚糖酶大都热稳定性差，酶作用的最适温度为４０～４５ ℃，５５ ℃以上快速失活。木聚糖酶要广泛经济高效应用于饲料工业应具备一定条件，要求饲用木聚糖酶有较好的热稳定性且在ｐＨ较宽的范围内能保持较高的活性。而现在颗粒料制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度为７５～９３ ℃，多数木聚糖酶在此高温下会大幅度地丧失活性；同时，饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是动物正常体温３７ ℃左右的胃肠中，因此能耐制粒高温，且在动物正常体温下具有较高活性成为木聚糖酶在生产中应用的关键。菌株Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ． ＦＬＨ２８所产木聚糖酶在ｐＨ ４．５～８．５时相对酶活性可达６０％以上，在温度６０ ℃时相对酶活性可达７３％以上，表明该木聚糖酶可很好地应用于食品及饲料工业中。

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