一株耐热脂肪酶产生菌XD-23的酶学性质研究

一株耐热脂肪酶产生菌ＸＤ－２３的酶学性质研究

李红宁１，２，杨滟菊２

（１．六盘水师范学院生物与地理科学系，贵州 六盘水５５３００４；２．云南师范大学生命科学学院， 昆明６５００９２）

摘要：从云南寻甸油污样中获得１株产脂肪酶的菌株ＸＤ－２３，研究了该菌株的酶学性质。结果表明，该菌株所产脂肪酶的最适反应温度为６０℃，最适反应ｐＨ值为６．０，为高温中性酶；酶活力在ｐＨ值４．０～７．０范围内较稳定，有一定的耐酸性；在６５℃保温３０ ｍｉｎ酶活力保留７０％，具有良好的热稳定性。金属离子Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｋ＋对酶活力有促进作用，Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｃｕ２＋对酶活力有抑制作用，ＥＤＴＡ、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋对酶活力影响不大；表面活性剂中ＥＤＴＡ对该酶有较小的抑制作用，浓度为０．１、０．５ g/L的ＳＤＳ能明显抑制该酶的活性，浓度为０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０和浓度为０．１、０．５ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００对酶活力有促进作用。

关键词：脂肪酶；酶活力；酶学性质

中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）09－1773-03

Enzymatic Properties of Lipase-producing Bacteria XD-23

ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｎｉｎｇ１，２，ＹＡＮＧ Ｙａｎ－ｊｕ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｉｕｐａｎｓｈｕｉ ５５３００４， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ bacteria ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｏｉｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｘｕｎｄｉａｎ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ and named XD23． Ｔｈｉｓ bacteria ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＸＤ－２３ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ６０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ pＨ ｗａｓ ６．０． Ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐＨ４．０～７．０； ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ｓｏｍｅ ａｃｉｄ－ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｉｔ ａｌｓｏ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ７０％ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｓｅｒｖｅｄ after ｂｅｉｎｇ ｋｅｐｔ ａｔ ６５ ℃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎｕｔｅｓ． Ｃａ２＋， Ｃｏ２＋， Ｋ＋ ｃｏｕｌｄ boost up ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｅｒｅａｓ Ｆｅ３＋， Ｐｂ２＋， Ｍｎ２＋， Ｃｕ２＋， Ａｌ３＋， Ｚｎ２＋ wｏｕｌｄ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｉｌｅ ＥＤＴＡ， Ｎａ＋， Ｍｇ２＋ ｈａｄ ｌｉｔｔｌｅ ｅｆｆｅｃｔ． ＳＤＳ at ０．１ g/L ａｎｄ ０．５ g/L ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｓｔｒａｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｗｈｉｌｅ Ｔｗｅｅｎ ８０ at ０．５ mL/L ａｎｄ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ at ０．１mL/L ａｎｄ ０．５mL/L ｃｏｕｌｄ strengthen ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ； ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

脂肪酶（Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）又称三酰甘油酰基水解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。脂肪酶可在油水界面或水不溶性系统中催化酯交换、酸解、水解、胺解、转酯、醇解、酯化等化学反应［１］，因此被广泛应用于食品、医药、环保、洗涤、制革、造纸、生物化工等行业［２］。近年来应用脂肪酶法催化合成绿色能源生物柴油，已成为一个新的研究热门［３，４］。由于脂肪酶应用潜力巨大，涉及的行业广泛，使得脂肪酶产生菌株再一次成为各个国家生物工程的研究热点。

微生物脂肪酶的研究为脂肪酶的应用提供了方便的材料来源途径。微生物脂肪酶具有丰富的资源，据估计有６５个属的微生物产脂肪酶［５］。微生物脂肪酶来源广泛，生长周期短，可工业化大规模生产，且成本低，具有良好的发展前景。本研究通过对脂肪酶产生菌的酶学性质进行研究，寻找性能优异的耐热、高活力、符合现代生物工程要求的脂肪酶，以期为微生物脂肪酶的生产提供优良菌株。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌种菌株ＸＤ－２３由云南寻甸油污样中获得，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。

１．１．２主要试剂Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、Na2HPO4·12H2O、橄榄油、酵母浸粉、蛋白胨、柠檬酸、酚酞、体积分数为９５％的乙醇、聚乙烯醇。以上试剂中聚乙烯醇购自Sｉｇｍａ公司，其余均为国产分析纯。

１．１．３培养基发酵培养基：橄榄油２．５０ ｇ，蛋白胨 ３．５０ ｇ，ＣａＣＯ３ ０．２５ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１０ ｇ，定容至５０ ｍＬ，ｐＨ值７．０。

液体种子培养基：酵母粉０．５ g，蛋白胨１．０ g，氯化钠１．０ g，定容至１００ ｍＬ，ｐＨ值６．８。

１．１．４主要仪器ＴＧ １６－Ｗ小型台式高速离心机，长沙湘仪离心机厂；ＳＷ－ＣＪ－２ＦＤ净化工作台，苏州智净净化设备有限公司；ＹＸ２８０Ａ手提式高压灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；２ＦＤ－５２５０恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器公司；ＹＰＷ－Ｉ回转式恒温调速摇瓶柜，上海通特电讯设备厂；ＧＢ１１２４０－８９恒温水浴锅，河北航天仪器厂；ＨＪ－４多头磁力加热搅拌器，金坛市亿能实验仪器厂。

１．２方法

１．２．１培养方法①种子培养。１００ ｍＬ的三角瓶装４０～５０ ｍＬ液体种子培养基，用牙签挑取初筛培养基中水解圈较大的单菌落于三角瓶中，于３７℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养１６～１８ ｈ。②产酶培养。２５０ ｍＬ的三角瓶装５０ ｍＬ发酵培养基，接种菌占培养基的体积分数为２％，３７℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养４８ ｈ。

１．２．２粗酶液的制备把经过产酶培养后的发酵液用无菌枪头吸取到１．５ ｍＬ的离心管里，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ，取出上清液，即为粗酶液。

１．２．３脂肪酶活力测定方法①脂肪酶活力测定。测定脂肪酶活力的方法有多种，本文选用碱滴定法［６］。脂肪酶作用于聚乙烯醇与橄榄油乳化形成的底物，将底物中的酯键水解生成脂肪酸，用标定好的标准ＮａＯＨ溶液滴定反应体系中的脂肪酸，以酚酞作为指示剂，滴定到终点后，根据所消耗ＮａＯＨ的量来计算脂肪酶的活力。酶活力的定义具体参照文献［７］，用橄榄油乳化液作为底物进行测定，在５０ ℃、ｐＨ值６．０条件下，每分钟催化底物生成

１ μｍｏｌ脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单位（Ｕ）。相对酶活力是指所测得的酶活力值与最高酶活力值的百分比。②脂肪酶活力的计算。脂肪酶活力（Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ１－Ｖ２）×Ｃ×１ ０００／t。式中，Ｖ１为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ｍＬ）；Ｖ２为滴定对照（未经处理的酶液为对照）时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ｍＬ）；Ｃ为氢氧化钠标准溶液浓度（ｍｏｌ／Ｌ），即０．２５ｍｏｌ／Ｌ；t为酶反应时间（ｍｉｎ），即１５ ｍｉｎ。

２结果与分析

２．１酶反应最适温度

为了测定酶反应的最适温度，将反应温度设置为８个梯度：２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０和９０ ℃。在反应组里加入１ ｍＬ酶液，分别置于８种温度下进行水解反应１５ ｍｉｎ，按照脂肪酶测定的碱滴定法测定酶活。由图１可知，酶反应的最适温度为６０ ℃，且在５０～７０ ℃条件下仍有较高的活力。

２．２酶的热稳定性

将恒温水浴温度设置为５个梯度：５０、５５、６０、６５、７０ ℃。取１ ｍＬ酶液分别置于不同温度的恒温水浴锅中保温３０ ｍｉｎ，用未经处理的酶液作对照，测定脂肪酶的酶活力。由图２可知，该酶具有较好的热稳定性，在５０～６０ ℃的条件下，保温３０ ｍｉｎ，其相对酶活力仍保持在８５％以上；温度高于６０ ℃时，酶活性迅速下降，在65 ℃时，相对酶活力为70%；在７０ ℃时，相对酶活力下降到不足３０％。

２．３酶反应的最适ｐＨ值

分别将不同ｐＨ值（２．０～９．０）的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与底物充分混和，加入１ ｍＬ酶液在最适温度６０ ℃条件下反应１５ ｍｉｎ，测定酶活力。由图３可知，该酶在ｐＨ值６．０时的酶活力最高，可知该酶为中性脂肪酶。

２．４酶的ｐＨ稳定性

将酶液与不同ｐＨ值（４．０～８．０）的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液等体积混合，室温下静置３０ ｍｉｎ，在６０ ℃，ｐＨ值６．０的条件下反应１５ ｍｉｎ，测定酶活力。由图４可知，在ｐＨ值４．０～７．０的范围内，相对酶活力仍保持在７０％以上，酶活性较为稳定。

２．５金属离子对酶活力的影响

用去离子水配制１２种浓度为１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的金属盐溶液，用酶液和金属离子溶液等体积充分混匀，以未加金属离子的酶液作为对照，室温下放置３０ ｍｉｎ，以对照组酶活力为１００％，用碱滴定法测定其酶活力。由图５可知，Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｋ＋对酶有激活作用，Ｆｅ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ａｌ３＋、Ｚｎ２＋对酶活力有明显的抑制作用；ＥＤＴＡ、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋对酶活力的影响不大。

２．６表面活性剂对酶活力的影响

配制不同种类及浓度的表面活性剂溶液，如表１所示，分别取５００ μＬ表面活性剂溶液和５００ μＬ酶液等体积混合，以未处理的酶液作为对照，室温下放置１ ｈ，测定各试验组及对照的相对酶活力，以对照组酶活力为１００％。结果表明，浓度为０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和浓度为０．１ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００均对酶活力有促进作用，两种浓度的ＳＤＳ对酶活力均有抑制作用，两种浓度的ＥＤＴＡ对酶活力也有一定的抑制作用，只有０．１ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０对酶活影响不大。

３小结

最近几年，各行各业的快速发展，对脂肪酶耐酸、耐碱、耐高温等特性提出了新的要求，而且已经成为国内外脂肪酶研究的一个重要方向［８，９］。本试验的研究结果表明，该菌株所产脂肪酶的最适反应温度为６０ ℃，为高温脂肪酶，且在５０～６0 ℃下仍具有较高的酶活力，具有一定的温度耐受性。最适ｐＨ值为６．０，在ｐＨ值４．０～７．０内酶活力较为稳定，有一定的耐酸性。表面活性剂中，浓度为０．５ mL/L的Ｔｗｅｅｎ ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和浓度为０．１ mL/L的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００对酶活力均有促进作用；这些性质表明该菌株具有较大的开发潜力。

参考文献：

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［２］ 温建新，施碧红，吴伟斌，等． 脂肪酶产生菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＦＳ３２１的分离鉴定及其产酶条件的初步优化［Ｊ］．食品与发酵工业，２００８，３４（２）：３７－４１．

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