碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化

摘要 利用筛选和验证相结合的方法筛选出了产碱性脂肪酶活性较高的菌株BL1011。经过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。运用单因素试验和均匀试验优化了BL1011菌株摇瓶产酶培养基和最佳发酵条件。在培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，大豆油0.5%，K2HPO4 0.2%，培养条件为起始pH值7.5，温度33 ℃，转速180 r/min，装液量20 mL，发酵周期为60 h的条件下，酶活力达到最高，为223 U/mL。

关键词 脂肪酶；筛选；发酵优化；均匀试验

中图分类号 Q55 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）22-0274-03

脂肪酶（lipase，E.C.3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶）是一种特殊的酯键水解酶，能在油水界面催化油脂水解，生成甘油和脂肪酸，具有化学选择性和底物选择性[1]。脂肪酶被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域[2]。尽管自然界中产脂肪酶的微生物很多，但用于商业化生产的细菌很少，主要有伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、无色杆菌属（Achromobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、色杆菌属（Chromobacterium）、产碱杆菌属（Alkaligenes）、节杆菌属（Arthrobacter）[3]。假单胞菌产碱性脂肪酶国内外虽有研究，但酶活力均不高[4]。该研究通过罗丹明B平板法快速筛选出一株产碱性脂肪酶能力较强的菌株，并对其产酶条件进行优化研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株。细菌：BL1001-1020；酵母：BL2001-2015；霉菌：BL3001-3025。试验菌株均由郑州轻工业学校食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏。

1.1.2 培养基。①种子培养基。细菌用调整LB培养基（pH值8.0），酵母用YPD培养基，霉菌用PDA培养基。②发酵培养基。细菌：蔗糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.1%，K2HPO4 0.2%，豆油0.5%，pH值8.5；酵母：麦芽糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，豆油0.5%，pH值8；霉菌：酵母膏0.2%，（NH4）2SO4 0.5%，KH2PO4 0.15%，Na2HPO4 0.35%，豆油0.1%，pH值8。③罗丹明B验证培养基。蔗糖0.3%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，（NH4）2SO4 0.1%，K2HPO4 0.2%，豆油0.5%，罗丹明B数滴，琼脂2%，pH值8.5。④基础培养基。麦芽糖0.5%，蛋白胨1%，K2HPO4 0.2%，pH值7.5。

1.2 试验方法

1.2.1 摇瓶产酶初筛。将上述不同菌株接入相应的种子培养基中培养，然后按2%的接种量接种到对应的发酵培养基中，细菌在37 ℃、200 r/min条件下发酵48 h，酵母和霉菌在28 ℃、180 r/min条件下发酵72 h后测定发酵上清液中的脂肪酶酶活，选择酶活力最高的菌株BL1011作为试验菌株。

1.2.2 碱性脂肪酶活力的测定[4]。采用分光光度法测定脂肪酶酶活。将酶活定义为60 ℃、pH值8.5时，1 min分解底物（对硝基苯酚十二烷酸酯）释放1 μmol对硝基苯酚的需酶量（U/mL）。

1.2.3 BL1011产酶验证[5]。采用罗丹明B平板对BL1011菌株是否产脂肪酶进行验证。倒罗丹明B平板，点种BL1011菌株后于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，分泌胞外脂肪酶的菌株周围会出现橘红色的圈，依据平板上是否形成橘红色圈进行产酶验证。

1.2.4 BL1011菌株产酶条件的单因素试验。该试验的单因素条件包括碳源、氮源、诱导剂、无机盐离子、起始pH值、温度、转速、时间。

1.2.5 BL1011产酶条件参数优化。根据单因素试验结果，设计均匀试验进一步优化产酶最佳配比和条件。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

2.1.1 摇瓶产酶筛选。摇瓶产酶筛选结果如表1所示，综合考虑酶活和最适pH值2个因素，选择BL1011作为试验菌株。

2.1.2 平板验证结果。将BL1011菌株点种到罗丹明B平板上，于37 ℃恒温培养箱中培养72 h，该菌株产生橘红色圈大而清晰，可以确定该菌株所产酶为脂肪酶。

2.2 BL1011菌株鉴定

2.2.1 BL1011菌落形态观察试验。BL1011的菌落呈圆形，边缘整齐，淡黄色，透明，正反面颜色一致；该菌株的细胞为短杆状，大小为2.0 μm×0.9 μm；革兰氏染色为阴性。

2.2.2 BL1011菌株的生理生化鉴定试验。该菌株的生理生化试验结果如表2所示。

2.2.3 BL1011菌株的分子生物学鉴定试验。以BL1011菌株基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA保守引物扩增，获得相应的DNA片段，测序结果表明，扩增片段为840 bp。GeneBank数据库BLAST结果表明，该菌与Pseudomonas sp. BJ-6、Pseudomonas sp.BJ-53的相似性达到99%以上，鉴定该菌株为假单胞菌Pseudomonas sp.。

2.3 BL1011菌株产脂肪酶单因素条件的优化

2.3.1 碳源对BL1011菌株产脂肪酶的影响。以基础培养基为基础，分别加入0.5%不同的糖为碳源，按2%接种量接种，在34 ℃、200 r/min发酵培养48 h后，取发酵上清测定脂肪酶酶活，结果如图1所示，以麦芽糖为碳源时酶活力达到最大。以麦芽糖为碳源，改变其浓度，其他发酵条件相同的条件下，考察不同麦芽糖浓度对BL1011产碱性脂肪酶的影响，结果如图2所示，当麦芽糖的浓度为1.0%时，该菌株产脂肪酶活力达到最大。

2.3.2 氮源对BL1011产脂肪酶的影响。以1%麦芽糖为碳源，在发酵培养基中分别加入1%不同氮源，按上述发酵条件培养48 h后，测定脂肪酶酶活，结果如图1所示，以蛋白胨为氮源，BL1011菌株所产脂肪酶活力最大。以相同方法考察不同蛋白胨浓度对BL1011产脂肪酶的影响，结果如图2所示，蛋白胨浓度为2.0%时，该菌株产脂肪酶活力最大。

2.3.3 诱导剂对BL1011产酶的影响。在上述碳源、氮源的基础上添加0.2%不同油脂以考察油脂对BL1011产酶的影响，结果如图3所示，采用豆油酶活达到12 U/mL。进一步考察不同豆油浓度对BL1011菌株产脂肪酶的影响，结果如图4所示，豆油浓度为0.4%时，菌株的产酶活力达到最大。

2.3.4 无机盐离子对BL1011产脂肪酶的影响。考察不同无机盐离子对产酶的影响，结果如图3所示，一定浓度的K+、Na+可以促进产酶，而其他离子对产酶均有不同程度的抑制作用。进一步考察不同K2HPO4浓度对酶活影响，结果如图4所示，当K2HPO4的浓度为0.2%时，酶活最高。

2.3.5 不同起始pH值对BL1011产脂肪酶的影响。配制起始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的发酵培养基发酵48 h后测定脂肪酶酶活，结果如图5所示，当起始pH值为7.5时，脂肪酶活力达到最大。

2.3.6 温度对BL1011产脂肪酶的影响。设定发酵温度分别为26、28、30、32、34、37 ℃，发酵48 h后测定脂肪酶酶活，结果如图5所示，当温度为30 ℃时，酶活达到最大，但当温度继续增加时该菌株产酶活力呈现下降趋势。

2.3.7 转速对BL1011产酶的影响。设定摇床转速分别为160、180、200、220 r/min，不同转速下发酵48 h，测定酶活，结果如图5所示，转速为180 r/min时，该菌产脂肪酶活力最大。

2.3.8 发酵时间对BL1011产脂肪酶的影响。该菌的发酵时间对产酶的影响如图5所示，当发酵时间为60 h左右时，脂肪酶酶活达到最大。

2.4 BL1011产脂肪酶条件参数优化

选取麦芽糖、蛋白胨、豆油、温度4个因子，每个因子取5个水平，选用均匀试验表U5（54）进行试验，结果见表3。

通过DPS软件回归分析，得到酶活大小（Y）与各因素（X）之间的关系方程为：

Y=217.025 000 0+1.993 000 000 0X1-26.617 714 286X2+0.844 742 857 1X22（R=0.999 8，F=982.178 8，P=0.023 5）

各因素的最佳组合为：麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，温度33 ℃，理论酶活可达228.28 U/mL。根据DPS软件回归分析结果进行验证试验，发酵上清最终酶活为223 U/mL。

3 结论与讨论

（1）利用摇瓶筛选和罗丹明B平板验证筛选出一株高产脂肪酶的菌株，经16S rDNA鉴定，表明该菌属于假单胞菌（Pseudomonas sp.）。

（2）通过单因素试验和均匀试验得到最优产酶培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，K2HPO4 0.2%；最佳发酵条件为起始pH值7.5，温度33 ℃、摇床转速180 r/min。

（3）该菌株对氮源的要求比较苛刻，有机氮源更有利于微生物脂肪酶的生产。

（4）对该脂肪酶的酶学性质进行初步研究，发现其最适作用温度为60 ℃，最适pH值为8.5，属于碱性脂肪酶，且耐热，该性质使其在有机合成中具有较大的应用潜力。

（5）无油脂存在时，BL1011菌株也产脂肪酶，可初步认为该酶为组成型酶，但一定量的油脂可以促进其产酶。

4 参考文献

[1] 麻琼丽，张家明.产脂肪酶菌株C7828-5的筛选、鉴定以及产酶条件的优化[J].工业微生物，2010，40（6）：39-44.

[2] 郭峥，张根旺.脂肪酶的结构特征和化学修饰[J].中国油脂，2003，28（7）：5-10.

[3] 王海燕，李富伟，高秀华.脂肪酶的研究进展及其在饲料中的应用[J].饲料工业，2007，28（6）：14-295.

[4] 刘瑞娟，王海宽，路福平.低温碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶培养基的优化[J].天津科技大学学报，2009，24（1）：6-10.

[5] 洪骏，夏黎明.产碱性脂肪酶菌株的筛选和培养[J].过程工程学报，2003，3（5）：428-432.