氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏抗氧化酶•ATP酶和AchE酶活性的影响

材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物。斑马鱼（Barchydanio rerio），购买于山西省太原市花鸟鱼虫市场，驯养14d，自然死亡率低于5%时开始试验。

1.1.2 试剂与仪器。过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S转移酶（GSTs）、丙二醛（MDA）、ATP酶（Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase）、AchE酶，均购自南京建成生物工程研究所；试验仪器有752分光光度计（上海舜宇恒平）、高速离心机、水浴箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 斑马鱼毒性试验。在体积为10 L的鱼缸内加入斑马鱼20条，鱼缸中的水为脱去氯气的自来水，pH为7，总硬度为268 mg/kg，水中溶解氧含量为7.8 mg/kg，控制室内温度在25 ℃。试验共采用10 L鱼缸2个，斑马鱼40条。试验采用半静态水生物测试法，每24 h更换1次农药药液，观察96 h内斑马鱼的死亡情况，采用概率分析法计算供试农药对斑马鱼的LC50值。

1.2.2 亚致死剂量毒性试验。

参照急性毒性试验的方法，以急性毒性试验测定的LC50值的1/10连续处理96 h。

1.2.3 样品的制备。

取斑马鱼肝脏组织，加入液氮研磨粉碎，然后加入生理盐水，8000 r/min离心10min，取上清液检测酶活性。

1.2.4 酶活性和MDA含量的测定。

①CAT活性。通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生1种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，计算出CAT的活性。②SOD活性。根据试剂盒说明书采用羟胺法测定，其原理为超氧阴离子自由基的最终产物在对氨基苯磺酸及甲萘胺的作用下呈现紫红色，在530nm处测定。③GST活性。根据动物体内源谷胱甘肽于化学结构不同的亲电化合物或代谢产物结合反应，生成2，4-二硝基苯-谷胱甘肽复合物于340nm处测定采用比色法测定。④MDA含量。根据通过硫代巴比妥酸需氧条件下孵育后产生粉红色反应，在530 nm处测定。⑤ATPase活性。根据ATP酶分解成ADP和无机磷，通过测定无机磷的含量，于660 nm处测定ATP酶活性。⑥AchE酶活性。根据水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生成对称三硝基苯黄色化合物，根据颜色深浅于412 nm下进行比色定量，通过水解产物胆碱的数量计算胆碱酯酶的活性。

1.2.5 数据处理。使用SPSS统计软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼毒性试验结果

通过斑马鱼毒性试验，测得氯吡嘧磺隆对斑马鱼的LC50（96 h）值为21.7 mg/L，根据《化学农药环境安全评价试验准则》[5]的评价标准，氯吡嘧磺隆对斑马鱼的毒性属于低毒，氯吡嘧磺隆的亚致死剂量浓度设为2.17 mg/L。

2.2 氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏中抗氧化酶活性的影响

从图1可以看出，在低剂量农药暴露下，与对照组相比斑马鱼肝脏中CAT、SOD和GST的活性均显著增加，而在高剂量浓度暴露下这3种酶活性显著下降。为了防御活性氧自由基的损伤和破坏，组织和细胞中建立形成了一整套完善的抗氧化防御系统，如CAT、SOD、GST。该试验中在低浓度氯吡嘧磺隆处理组中，抗氧化酶活性增加说明整个机体过氧化物增多，自由基在机体内积累，机体处于应激状态，为了减轻肝脏损伤，其抗氧化酶活性增强。随着处理组的氯吡嘧磺隆浓度增大，过氧化物和自由基大量积累，肝脏细胞造成不可逆的损伤，抗氧化酶活力受到显著抑制。MDA是脂质过氧化物的产物，其含量直接反映了细胞氧化损伤程度。MDA含量在低剂量氯吡嘧磺隆暴露下显著增加，在高剂量氯吡嘧磺隆的暴露下较对照组和低剂量组MDA含量增加。

2.3 氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏中Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性的影响

从图2可以看出，在低剂量氯吡嘧磺隆暴露下斑马鱼的Na+K+、Ca2+Mg2+ -ATPase活性显著下降，在高剂量氯吡嘧磺隆暴露下Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性较对照组和低剂量组下降得更多。经推测，可能是由于氯吡嘧磺隆首先对斑马鱼机体肝脏组织造成氧化损伤，进而改变了ATP酶蛋白的构象和功能，使得酶活性下降。

2.4 氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏中乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响

从图3可以看出，在低剂量氯吡嘧磺隆暴露下斑马鱼的AchE酶活性并无显著下降，但是在高剂量氯吡嘧磺隆暴露下AchE酶活性较对照组和低剂量组下降显著。推测其原因可能是由于氯吡嘧磺隆首先对斑马鱼机体肝脏组织造成氧化损伤，肝脏的防御体系被外源毒物破坏，致使器官的功能受到抑制，使得酶活性下降。乙酰胆碱酯酶主要功能是将乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱，维持神经系统的正常生理功能，其活性是衡量生物生理活动的重要指标之一[6]。因此，即使氯吡嘧磺隆非神经性毒物，笔者研究了乙酰胆碱酯酶的活性。

3 讨论与结论

胡传禄等[7]研究了磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆对斑马鱼胚胎的影响，结果表明MDA含量随着染毒浓度的升高而增加。张彬彬[8]研究了苯磺隆对鲫鱼肝脏的影响，结果表明苯磺隆对GSTs和SOD活力具有诱导作用。

笔者采用半静态水生物测试法测得氯吡嘧磺隆对斑马鱼96 hLC50为21.7 mg/L，农药毒性为低毒，对水生生物较为安全。在致死中浓度暴露下，斑马鱼肝脏中抗氧化酶和ATP酶活性显著下降；在亚致死剂量浓度下，斑马鱼肝脏中抗氧化酶活性升高，机体应激水平增强，但ATP酶和AchE酶活性降低，表明对斑马鱼肝脏仍然造成了一定的损伤。

参考文献

[1] 杨厚学.《农药残留危害风险评估》实用手册[M].北京：化学工业出版社，2011：138-140.

[2] 刘进玺，钟红舰，吴绪金，等.氯吡嘧磺隆在玉米植株及土壤中的消解动态研究[J].河南农业科学，2012，41（3）：90-93.

[3] 谢娜，王金信，侯珍，等.氯吡嘧磺隆除草活性及对不同玉米品种的安全性[J].植物保护学报，2012，39（5）：461-466.

[4] 陈琦，徐志军，焦伟.氯吡嘧磺隆防治红薯地杂草及安全性试验[J].农药，2013，52（5）：369-370.

[5] 中华人民共和国农业部.化学农药环境安全评价试验准则：GB/T 31270.3—2014[S].北京；中国标准出版社，2004.

[6] 徐晓白.典型化学污染物在环境中的变化及生态效应[M].北京：科学出版社，1998：322-376.

[7] 胡传禄，玉晓微，赵占克，等.苄嘧磺隆对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J].公共卫生与预防医学，2011，22（6）：1-4.

[8] 张彬彬.苯磺隆对肝脏谷胱甘肽硫转移酶和超氧化物歧化酶的影响[J].滨州医学院学报，2012，35（4）：255-257.