植物三萜皂苷代谢中达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶的生物信息学分析

计划（编号：201811396018X）。

通信作者：赵志新（1982—），男，河南滑县人，博士，讲师，从事药用植物转录组代谢及基因组进化研究。E-mail：zxzhao@slxy.edu.cn。

三萜皂苷类化合物在自然界中分布广泛，菌类、蕨类、单子叶植物、双子叶植物、动物及众多海洋生物均可产生，尤以双子叶植物含量最佳。目前在人参、三七等药用植物中的研究比较成熟，同时在桔梗中三萜皂苷的含量也比较高[1]。三萜皂苷是一类重要的植物次生代谢产物，具有抗癌、抗病毒、降低胆固醇等药理作用[2]，但三萜皂苷结构和生物合成途径复杂，在植物产量低，提取成本高，因此，对三萜皂苷生物合成途径研究并通过合成生物学等方法生产三萜皂苷已成为研究热点，合成生物学在三萜类药效成分或其前体的大规模生产应用方面具有广阔前景[3-6]。

达玛烷合成酶（dammarenediolsynthase，简称DS）和β-香树脂合成酶（β-amyrin synthase，简称β-AS）同属氧化鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclase，简称OSC）家族，催化2，3-氧化鲨烯环化合成达玛烷二醇和β-香树素，它们分别是合成达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷的关键酶[1]。近年来，随着植物次生代谢途径（甾醇类化合物、丹参酮和紫杉醇等生物合成途径）及其关键酶基因研究的深入，越来越多的关键酶基因被克隆，通过基因工程和合成生物学的方式对药用植物进行遗传改良，提高药用植物体内甾醇类化合物、丹参酮、紫杉醇的产量，已成为最有发展潜力的产业之一，达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶是此类物质合成中2种关键的分支代谢控制酶[7]。

本研究通过查阅相关资料，搜集已公布的植物中达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶序列，通过生物信息学工具，对这2种酶进行理化性质分析、糖基化位点预测、信号肽预测、二级结构预测以及系统进化树构建等方面综合研究分析，以便更加深入地理解达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶的蛋白特性，并预测不同植物之间的亲缘关系，为以后研究这2种酶的酶学特征及三萜皂苷代谢提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

通过查阅文献，并登陆NCBI检索已公布的植物中达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶序列（包括核苷酸序列及其相对应的氨基酸序列），共获得4种植物的10条达玛烷合成酶序列及22种植物的30条β-香树脂合成酶序列（表1）。

1.2 方法

氨基酸序列的理化性质的分析使用Expasy网站提供的的ProtParam在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）;通过NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在線工具分别分析糖基化位点; 使用SignalP 4.1在线工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测信号肽;通过SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测二级结构;最后使用MEGA 6.0构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 不同植物达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶氨基酸序列的理化性质分析

2.1.1 不同植物的达玛烷合成酶氨基酸序列的理化性质 由表2可知，各植物的达玛烷合成酶基因全长上在2 280～2 540 bp 之间，且在大多在2 310 bp左右;氨基酸数目均为769个，表现出高度的保守性。谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）均为含量丰富的氨基酸，从而可知这3种氨基酸对于达玛烷合成酶的组成和结构具有重要作用。正电荷残基[精氨酸（Arg）+赖氨酸（Lys）]大多为85个，只有越南人参为84个，负电荷残基[天冬氨酸（Asp）+Glu]为91个或92个。pI值在6.40 左右，而不稳定指数各不相同;脂肪指数均在80.00左右，且相差极小。这4种植物的10条达玛烷合成酶序列在氨基酸数目、种类及比例、分子量、理论pI、正负电荷残基和脂肪指数上都表现出高度的一致性。由此可知，达玛烷合成酶氨基酸序列存在高度的保守性。

2.1.2 不同植物的β-香树脂合成酶氨基酸序列的理化性质

由表3可知，22种植物的30条β-香树脂合成酶的基因序列全长除蒺藜苜蓿1（其基因序列未知）外，其他均在2 000～2 800 bp之间;氨基酸数目除熊胆草为672个，其他植物在690～780个之间，表现出较强的保守性。除豌豆含量最丰富的氨基酸为Glu、Leu、异亮氨酸（Ile）外，其他植物均是Leu、Glu和Gly，而吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）为β-香树脂合成酶序列中都不存在的氨基酸。正电荷残基在67～81个之间，负电荷残基在76～94个之间，并且各序列中负电荷残基均大于正电荷残基数，pI值在5.89～6.41 之间，脂肪指数为80左右，而不稳定指数各不相同。这22种植物的β-香树脂合成酶氨基酸序列在氨基酸数目、种类及比例、分子量、理论pI、正电荷残基、负电荷残基和脂肪指数上都表现出较强的一致性。由此可知，β-香树脂合成酶氨基酸序列在理化性质方面具有较强的保守性。

2.2 不同植物达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶糖基化位点分析

2.2.1 不同植物达玛烷合成酶糖基化位点分析

由表4可知，这10条达玛烷合成酶序列的最可能糖基化位点无一例外均是551 NPSE处，同时可能性均在0.673 2或0.673 3，N-糖基化结果也都是在551 NPSE处为++。说明达玛烷合成酶糖基化位点在这10条序列中具有高度的保守性和统一性。

2.2.2 不同植物β-香树脂合成酶糖基化位点的预测分析

表5显示，β-香树脂合成酶糖基化位点相较于达玛烷合成酶

具有明显的差异性和多样性，糖基化位点数量从1～3个不等;可以看出可能性最大处基本上都在550附近。并且大豆（2）的可能性高达0.914 7，预测结果中大豆（2）、绿玉树和木榄均有“+++”，显示这3条序列有极大的可能性有糖基化位点。

2.3不同植物达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶蛋白质信号肽分析

2.3.1 不同植物达玛烷合成酶信号肽分析

使用Signal P 4.1 Server在线工具，首先对越南人参达玛烷合成酶信号肽进行分析（图1）。结果表明，越南人参玛烷合成酶中不存在信号肽，而且信号肽值（S值）和结合剪切位点值（Y值）均都是非常低的，所以可以推断越南人参DS蛋白经过核糖体合成后，所得到的蛋白质为非分泌蛋白。同时对其他9条序列玛烷合成酶分析，得到与越南人参近似的结果，即均不含有信号肽，都可能为非分泌蛋白。

2.3.2 不同植物β-香树脂合成酶信号肽分析

使用Signal P 4.1 Server在线工具， 首先对珠子参β-香树脂合成酶信號肽进行分析（图2）。结果表明，珠子参β-香树脂合成酶也不存在信号肽，而且S值和Y值都是非常低的，所以可以推断珠子参的β-香树脂合成酶同达玛烷合成酶一样，为非分泌蛋白。同时，对其他29条序列进行分析，也得到与珠子参近似的结果，即均不含有信号肽，都可能为非分泌蛋白。

2.4 不同植物达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶二级结构分析

2.4.1 不同植物达玛烷合成酶二级结构分析

由表6可知，4种植物的10条达玛烷合成酶序列中二级结构α-螺旋呈现的概率最高，为43%左右;其次为无规卷曲，出现的概率在36%左右;延伸链的概率在13%左右;而β-转角出现的概率最低，是7%左右。除此之外，无其他结构存在，且各链中各二级结构元件的比例都十分接近。说明达玛烷合成酶二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主，且不同植物中二级结构十分相似，表明玛烷合成酶在二级结构层面具有很高的保守性。

2.4.2 不同植物β-香树脂合成酶二级结构分析

由表7可知，类似于达玛烷合成酶的结果，22种植物的30条β-香树脂合成酶二级结构中，α-螺旋呈现的概率最高，在45%左右，其次是无规卷曲，为35%左右，延伸链呈现的概率为13%上下，而β-转角比例最低，为7%左右。除此之外，均无其他二级结构存在;同样，各链中各结构的比例均十分接近。从而推测这些β-香树脂合成酶来源于同源蛋白，其功能发挥与其特定的二级结可能有关，同时说明β-香树脂合成酶在二级结构层面也具有很高的保守性。

2.5 不同植物达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶系统进化树构建

综合前面分析结果，初步判断这4种植物的10条达玛烷合成酶和22种植物的30条β-香树脂合成酶具有很高的保守性及同源性。为进一步分析这2种不同酶的亲缘进化关系，利用MEGA 6.0软件，使用Neighbor-joining算法构建系统进化树。

2.5.1 不同植物达玛烷合成酶系统进化树构建

由图3可知，以Neighbor-joining算法构建的达玛烷合成酶系统进化树可聚成三大支。首先越南人参单聚为一大支，它与其他序列距离最远;其次人参（1、2和3）和西洋参（1、2和3）距离较近，可以聚为一支;最后三七（1、2和3）聚为一支，它与其他序列最远。在进化树中可以明显看出，同一物种不同序列首先聚为一支（西洋参2除外），这也与传统的植物分类结果相符。

2.5.2 不同植物β-香树脂合成酶系统进化树构建

由图4可知，以Neighbor-joining算法构建的β-香树脂合成酶系统进化树可聚成三大支。首先长春花、积雪草和人参（3）可聚为一类;其次以竹节参、珠子参、西洋参（1和2）、柴胡、人参（1和2）、龙牙楤木、番茄、麻花秦艽、东北白桦、绿玉树、木榄、熊胆草和青蒿可为一支;最后蒺藜苜蓿 （1、2和3）、豌豆（1和2）、大豆（1和2）、光果甘草（1和2）、乌拉尔甘草和细叶远志可聚为一支。该结果基本与传统的植物分类结果相一致，显示β-香树脂合成酶系统进化树与植物本身进化关系相一致。

3 讨论与结论

本研究搜集4种植物的10条达玛烷合成酶序列，以及22种植物的30条β-香树脂合成酶序列，利用生物信息学工具对这2种代谢关键酶的理化性质、蛋白特性及进化亲缘关系等进行了较为全面的分析。理化性质分析显示， 这2种酶的氨基酸序列在氨基酸数目、种类及比例、分子量、理论pI、正电荷残基数、负电荷残基数和脂肪指数上都表现出较强的一致性，由此可以推测，达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶的氨基酸序列在理化性质方面具有较强的保守性，这与达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶为三萜皂苷代谢的关键酶的特性相符合[1]。同时研究表明，10条达玛烷合成酶和30条β-香树脂合成酶的糖基化位点具有高度的保守性和统一性，这与理化性质的分析结果相一致;并且大豆（2）、绿玉树和木榄这3条β-香树脂合成酶序列有极大的可能性有糖基化位点。

蛋白信号肽预测分析表明，达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶没有明确的信号肽，推测这2种酶不属于分泌蛋白，而是直接在合成部位行使催化功能，不须要分泌转运到外部，并且研究已证明西洋参中β-香树脂合成酶属于非分泌型蛋白及非跨膜蛋白[8]，这与本研究结果相一致。二级结构预测分析发现，α-螺旋和无规则卷曲是多肽链中主要存在结构元件，并且分散在整个多肽链中，表明这2种酶具有明显的一致性，从而推测这2种酶功能的发挥与其特定的二级结可能有关。虽然这10条达玛烷合成酶和30条β-香树脂合成酶来源于不同的植物科属，但由于氨基酸理化特性及二级结构等方面总体比较相似，因此进化树也表现出差异较小的特点，并且聚类分支也与该序列的科属特性相一致;同时研究也表明，人参达玛烷合成酶與西洋参、三七、积雪草、长春花、大豆和乌拉尔甘草等进化分析的结果与植物种属之间的自然进化关系相一致[9]。

综合以上结果分析表明，达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶在理化性质、糖基化位点、信号肽和二级结构等方面均表现出极高的一致性，表明这2种酶具有很高的同源性，并且它们基因的保守性也较高，同时进化分析与传统的种属分类结果相一致。本研究通过对不同来源的达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶系统的生物信息学分析发现，这2种酶均具有较高的保守性特征，为将来利用基因工程技术生产这2种酶提供参考。同时，对达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶蛋白特性及亲缘关系的解析，能够更清楚地揭示酶的保守结构域及进化变异，为进行基因工程改造和分子进化研究提供借鉴，本研究也可为分析达玛烷合成酶和β-香树脂合成酶酶学特征及三萜皂苷代谢提供帮助。

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