与脑梗死关联的氨基酸代谢通路研究进展与发现

摘要] 本文通过检索文献，分析近年来应用代谢组学手段检测到的与脑梗死相关氨基酸以及代谢通路的文章，讲述了氨基酸的代谢变化与脑梗死的相关性，发现在脑梗死产生、演变过程中产生作用或者发生异常的有7种氨基酸以及多条代谢通路，并且从分子微观层面上描述了脑梗死的发生机制，发现脑梗死机制多集中于三羧酸循环能量代谢失衡、缺血缺氧以及兴奋毒性作用。

[关键词] 氨基酸代谢；缺血性脑梗死；代谢组学；代谢通路

[中图分类号] R743.330.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0024-04

脑梗死是临床常见病，具有较高致残率，严重影响患者生活质量。目前，临床上对脑梗死的诊断、治疗主要依赖患者出现的神经功能缺损及CT、MRI扫描等影像学检查并结合临床医生的经验加以判断，尚缺少及时有效的诊断手段，同时对于微小血管梗死很容易延误诊断。如果能提高对脑梗死早期的预防与发现便可有效降低脑梗死的致残率。目前应用代谢组学方法，可以发现部分疾病早期潜在标志物并进行早期分类诊断，这种方法已经应用于脑梗死疾病的研究中[1-2]。

代谢组学代表一个新生的系统生物学的学科，通过研究生物系统潜在的代谢产物，提供了生物系统表型的一个准确和动态的画面，反映环境或生活方式与生命系统相应基因的整体和同步代谢图谱的变化，可用于靶向治疗与新药的发现。代谢组学网络结构同样可以显示疾病导致的相关的代谢物与多个通路造成的扰动，这种方法通过捕捉生物样本低分子量代谢物水平的变化，来阐明网络路径的扰动与疾病的关系[3-4]。与代谢密切相关的代谢物的生物活性产物主要包括碳水化合物、脂类、脂肪酸、核苷酸、蛋白质分子、氨基酸等[5]。全谱氨基酸在体内保持平衡，氨基酸代谢池的失衡是许多疾病诱使或表述的形式之一。通过对氨基酸的精确检测，可以揭示身体的氨基酸代谢，从而被用来作为医疗诊断和发现与预防疾病的重要手段。另外，氨基酸主要代谢途径可以潜在反映神经内分泌系统、氨或硫等的能量代谢系统的异常，是人类健康的提示，具有重要的临床意义[7-8]。

氨基酸的研究是代谢组学中较为重要的一环，因此研究缺血性脑梗死大脑细胞缺血期在血清中所造成的氨基酸分子的微量变化具有一定意义。神经系统中有大量的游离氨基酸、γ-氨基丁酸（GABA）、天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、牛磺酸（Tau）、甘氨酸（Gly）、色氨酸（Trp）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）等和中枢神经系统代谢密切相关，其中GABA、Glu、Asp、Tau和Gly是非常有代表性的兴奋或抑制性神经递质，且与神经系统疾病的转归相关[9]。

氨基酸是蛋白质的组成单位，也是卟啉、嘌呤、嘧啶、甲状腺激素等生物合成的前体。氨基酸的研究是代谢组学中较为重要的一环。因此研究缺血性脑梗死大脑细胞缺血期组织中所造成的氨基酸分子的微量变化具有一定意义。神经系统中有大量的游离氨基酸，GABA、Asp、Glu、Tau、Gly、Trp、Ser、Arg等和中枢神经系统代谢密切相关，GABA、Glu、Asp、Tau、Gly是非常有代表性的兴奋或抑制性神经递质，且与神经系统疾病的转归相关[9]。

1 与大脑代谢相关的游离氨基酸

在脑脊液的游离氨基酸中，Glu含量最高，Tau其次，再次为Asp，其余依次为Ser、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸，但是其含量与功能并不相关，脑组织中氨基酸氮总量为血清中氨基酸氮的6倍，其中Glu和Asp是最主要成分。正常情况下血脑屏障维持脑组织中游离氨基酸高浓度和血清间浓度梯度，当脑梗死发生后血脑屏障破坏，脑脊液含量增加。这些氨基酸大部分能透过血脑屏障进入外周血液[10]。

1.1 兴奋性氨基酸——天门冬氨酸与谷氨酸在脑组织中的作用

Asp是Glu利用维生素B6转化而来的一种非必需氨基酸，该氨基酸偏高常发生于脑梗死或者癫痫患者。Glu在学习与记忆、神经元损伤等生理和病理生理过程中起着关键作用，作为机动性的神经递质它不易通过血脑屏障，因此不能通过血液供给脑，必须由生物化学途径在脑内合成以完成脑内代谢[11]。

1.2 抑制性氨基酸——甘氨酸和γ-氨基丁酸在脑组织中的作用

Gly主要抑制N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）对抗其受体的激活效应。γ-GABA作为抑制性神经递质之一，γ-GABA由L-Glu谷氨酸脱羧酶催化，谷氨酸脱羧基生成，此酶在脑组织中的含量很高，所以大脑中γ-GABA含量较高，二者作为抑制性神经递质，对中枢神经系统有抑制作用。

1.3 色氨酸、牛磺酸和赖氨酸在脑组织中的作用

Trp可与大脑中的一种重要神经传递物质5-羟色胺相互转化，其通过中和肾上腺素和去甲肾上腺素，与抑郁症、失眠症和精神分裂症的发生关系密切，并可改善睡眠的持续时间。Tau是非蛋白质氨基酸，在脑组织含量丰富，分布广泛，Tau蛋白是一种细胞内游离β-氨基酸，可兴奋神经血管平滑肌和骨骼肌组织，抑制神经细胞的兴奋性，增强抽搐和神经缺氧的耐受性。动物实验表明，Tau可以改善脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中SOD的活性，消除自由基[13]。赖氨酸（Lys）为人体必需氨基酸，能通过血脑屏障，提高血脑屏障的通透性，促进脑组织的生长[12]。

理论上，因为脑组织与外周血的氨基酸浓度差异，外周血中的Tau、Trp、Lys的含量应该随着血脑屏障的破坏而增加，导致脑脊液与外周血中氨基酸含量比例异常。

2 脑梗死代谢通路的研究

代谢途径就是体内的一个个相关的代谢反应步骤首尾相连而构成的通路。生物体内的新陈代谢可以分解为一条条代谢途径来研究和理解。一条代谢途径的终产物或中间产物，很可能是另一条代谢途径的反应底物，这样不同的代谢通路之间就产生了联系[14]。

经查阅文献发现，目前代谢通路研究方式主要是通过基于KEGG pathways数据库的差异代谢物或者差异表达基因功能富集分析，只针对经典通路的研究，有价值的特异性通路还有待研究[15-16]。另外，代谢组学对代谢路径的研究还不是很成熟，主要原因就是测定代谢路径比测定代谢产物更为困难，只能进行间接的定性估计，从一个个点的代谢物到一条完整的代谢路径还有很长的过程，目前只停留在一个个点的代谢物，而对中间产物、终产物、作用酶及相关受体的研究都很难[17]。

通过对已知的脑梗死代谢途径、相关酶及其调控方式、代谢流和转运系统的分析研究进行检索，发现已有研究如下：

2.1 无氧糖酵解途径

大脑器质性损伤造成脑组织缺血缺氧，进而造成生化代谢功能异常。Mayumi等[20]研究提示血流量受限时，造成葡萄糖和氧供应不足，糖酵解产生的葡萄糖-6-磷酸下降，进而三羧酸循环无氧糖酵解反应加剧。图1显示的是三羧酸循环糖酵解代谢路径，其为细胞代谢提供能量。有研究通过脑梗死大鼠造模以后发现，血浆葡萄糖-6-磷酸和核糖含量下降，柠檬酸含量增高；又通过磷酸戊糖途径，膜脂质过氧化，膜磷脂释放，核糖含量降低，终产物花生四烯酸和二十二碳六烯酸升高。

Munger等[21]通过对脑缺血动物模型血清氨基酸的组成进行前后检测，并采用C13同位素追踪氨基酸的来源，发现胞质内来自草酰乙酸（OAA）、丙酮酸（Pyr）、磷酸烯式丙酮酸和3磷酸甘油酯（3-pg）的氨基酸相对增加而来自线粒体α-酮戊二酸（α-KG）的氨基酸相对减少。可见，在减少氧气水平的情况下体细胞的氨基酸合成，似乎是增加糖酵解和减少氧化柠檬酸循环的通量造成的。

2.2 GLU-NMDA代谢路径

脑缺血后，由于缺乏能量，从细胞内释放的G1u数量增加，细胞外G1u迅速升高。兴奋性氨基酸（EAA）浓度增加，激活的NMDA受体，调节钙通道开放，导致细胞Ca2+内流，过载并激发大量的自由基后，Glu突触后受体过度激活，钙离子内流或从细胞内钙释放，激活酶、触发信号级联反应。同时通过介导Na+内流，增加水钠交换，细胞Cl-伴随水分子进入细胞内，水含量增加、细胞肿胀、溶解和脑组织损伤[18-19]。

2.3 叶酸缺乏途径

Jung等[23]通过造模发现活动区脑组织的叶酸减少，而甲酸增多。通过叶酸代谢通路，甲酸是通过叶酸结合四氢叶酸，再通过甲酰四氢叶酸合成酶来介导形成10-甲酰四氢叶酸形式来完成氧化。同时又发现甘氨酸合成通过丝氨酸四氢叶酸。因此，脑缺血以后，叶酸缺乏与甲酸增加和甘氨酸降低相关。以此证明这些高浓度水平的甲酸势必会加速脑组织代谢性酸中毒。

2.4 酶-自由基级联反应

级联反应发生在缺血后的数秒至数周，氧自由基和其他信使激活炎症因子和酶，导致活化的小胶质细胞，产生炎症。一些酶产生氧自由基，它本身也作为第二信使，破坏细胞的蛋白质、糖类、脂肪酸等。炎症本身产生自由基，导致一个恶性循环。酶和炎症产生的氧自由基损伤DNA，其他机制可能导致神经细胞凋亡[20]。

3 氨基酸代谢路径

氨基酸的代谢路径在生命体的新陈代谢过程中，起着至关重要的作用，因为蛋白质在酶解后基本上以氨基酸的形式吸收，而且氨基酸代谢参与重要的三羧酸循环，是三大营养素（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽，氨基酸的代谢与疾病的关系一度成为代谢组学研究的热点[21]。

3.1 兴奋毒性机制

脑缺血发生以后，脑细胞处于缺血缺氧的状态，动物实验研究结果显示，中风区脑组织中EAAs释放增多，当脑缺血时，ATP合成不足，细胞能量供应减少导致EAAs灭能减弱，抑制性氨基酸代谢减慢，从而使兴奋性与抑制性氨基酸之间的比例失调[22-23]，最终导致神经元细胞不可逆性的损伤。脑缺血以后，血脑屏障受到损害，通透性增加，势必造成外周血中与脑组织中的相关氨基酸浓度变化[24]。

王介明等[25]对52例脑出血、48例脑梗死患者同时进行了血液内EAAs测定观察，结果出血组Glu增加151.1%，Asp增加65.1%；梗死组分别增加133.4%与64.2%。因此EAAs拮抗剂或其他治疗成为临床疗效观察和评价的指标，应用观察外周血动态变化的EAAs，可以反映大脑缺血缺氧的状态。因为临床证实当脑细胞缺氧损伤后，不仅在脑组织，同时在外周血EAAs也显著增加，可以为临床提供客观的诊断参数，从而提高疗效。

Gordon等[26]通过颈动脉结扎的中风动物模型，发现目标区域Glu再摄取受到强烈抑制，Glu受体分布的不可逆混乱，Glu受体拮抗剂弱化了受伤的严重程度。同时还观察到，在缺血状态下纹状体和海马细胞外液Glu和Asp的浓度显著上升。实验证据表明，EAAs与大脑神经血管缺血缺氧的病机有关，容易产生EAAs介导的神经损害，突触周围高浓度内源性Glu或Asp可能产生神经毒素。

3.2 高同型半胱氨酸血症

高同型半胱氨酸血症是脑梗死的独立危险因素，高同型半胱氨酸可以通过引起内皮细胞受损、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制诱发脑血管疾病。Schauer等[27]研究显示，观察组男、女性脑梗死患者血浆同型半胱氨酸水平显著高于对照组，说明高同型半胱氨酸血症与脑梗死密切相关。

3.3 缺氧情况下的氨基酸代谢流的变化

Marc等[28]观察了毕赤酵母菌缺氧时氨基酸代谢流的变化，总体数据反映了氧依赖情况下的氨基酸合成路径的转录调节，发现在生物合成路径上几个关键调节酶转录水平和其通过的碳流量，以及与它们相应的最终代谢产物的水平呈现负相关，提示了负反馈控制的途径。例如，氧限制条件下游离水平酪氨酸和苯丙氨酸大大增加，与此同时ARO7的mRNA表达水平降低，同时观察游离的色氨酸池和TRP3转录水平，蛋氨酸生物合成途径也存在类似情况。在谷氨酸族，氧限制条件下流向赖氨酸碳流增加，伴随几个基因表达水平降低，尤其是第一反应通路的LYS20。另外，在低氧的情况下碳通量的谷胺酸生物合成途径与Gln显著降低，这种模式导致GDH3和GLN1相关转录水平直接减少。

同时还发现氨基酸代谢池呼吸商降低，以及乙醇和arabitol的利用率降低，符合以前转录组、蛋白质组和代谢通量分析，解释了氧供应量的变化对细胞的氨基酸的代谢造成的影响[28]。

4 讨论

代谢组学采用“自上而下”的策略来反映生物体从整体环境上由代谢网络和药物目标网络造成的改变所引起的终端的症状的变化，并且帮助理解由于这种改变干预了药物作用网络的机制。它在许多领域扮演了越来越重要的角色，如应对环境保护压力、毒理学、营养研究的整体效应、糖尿病、肠道功能生态学、疾病诊断、药物的代谢与天然产物的发现等[27-28]。

从目前已有的研究结果和以往文献网络部分的分析来看，脑梗死的发生发展过程涉及多系统、多环节结构和功能的异常，并非单一基因、单一通路或单一系统的表达发生变化，而是多途径和多个系统发生了网络式的变化，是典型的多基因复杂疾病。

代谢通路异常包括酶、基因、代谢物、受体及转运因子的异常[29]。因此建立有效的药物筛选目标，是有效预防和控制药物的基础和前提，单个目标的预防和控制措施很难取得预期效果，应该通过多个目标进行全面干预，来提高脑梗死的防治水平。从预防和治疗药物的发现和创新角度出发，可以发现、研究和建立一套和脑梗死在脑与认知功能障碍病理变化密切相关和互补关系的目标，对药理学和病理生理学研究具有重要意义[30]。

5 结论

经阅读文献发现，与脑梗死相关的氨基酸主要有Glu、Asp、GABA等，其兴奋与抑制的作用严重影响了大脑细胞的代谢作用，而已知的脑梗死代谢通路很多，多集中于三羧酸循环能量代谢失衡、缺血缺氧以及兴奋毒性机制，但是还不能为脑梗死提供针对性的诊断与治疗，对于脑梗死的特异性代谢物及特异性代谢通路的研究还需进一步加强。

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（收稿日期：2013-06-14 本文编辑：程 铭）