不同提取方法对槐耳提取物的粗多糖含量及K562细胞抑制作用的影响

采用普通水提法、高温高压水提法、冷碱法、热碱法对槐耳（Trametes robiniophila）子实体进行提取，考察了水溶性提取物中粗多糖含量、粗多糖实际得率和对K562细胞的抑制率。碱提法水溶性提取物的得率高于水提法，其中热碱法提取物的得率最高为29.65%，但其粗多糖含量最低，冷碱法粗多糖的实际得率最高为6.93%。四种提取物对K562细胞均有抑制作用，热碱法提取物浓度为2 mg/mL作用于K562细胞72 h后，抑制率高达92.28%。

槐耳； 提取物； 提取方法； 粗多糖； K562； 抑制率

槐耳（Trametes robiniophila）是我国民间重要的药用真菌，中药名为槐栓菌[1]，生长在槐及洋槐、青檀等树干上，具有“治风”、“破血”、“益力”的功效，民间多用于治疗癌症和炎症，抗癌新药金克槐耳颗粒已广泛地用于各种恶性肿瘤的治疗，其主要活性成分为多糖蛋白[2]。真菌多糖的提取方法有水提法、酸提法、碱提法、盐析法、酶法、超声波法、超临界流体提取法等[37]，而对于槐耳的研究，近年来主要集中在槐耳颗粒或浸膏对肿瘤细胞抗性方面[810]，鲜见槐耳提取方法的研究。因此笔者采用普通水提法、高温高压水提法、冷碱法、热碱法对槐耳子实体进行提取，比较水溶性提取物的粗多糖含量、粗多糖实际得率和其对K562细胞的抑制率，为槐耳产品的生产提供参考。

1材料与方法

1.1供试材料与细胞株

槐耳人工栽培子实体由青岛农业大学应用真菌省级重点实验室提供（菌株为T191，培养料配方：国槐木粉89%，麦麸10%，石膏1%）。K562白血病细胞株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2试剂

RPMI1640培养基、胎牛血清为Thermo Fisher公司产品；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide， DMSO）为Sigma公司产品；其它试剂为国产分析纯。

1.3提取方法

槐耳子实体掰成小块风干至恒重后，用粉碎机粉碎，过100目筛，分别用不同方法提取。每种方法取25 g子实体干粉，进行脱脂预处理，即以CHCl3∶MeOH∶H2O=10∶10∶3的比例分别加入三氯甲烷200 mL、甲醇200 mL、蒸馏水60 mL，搅拌均匀后于25 ℃下静置2 d，抽滤去上清后烘至恒重[11]。

1.3.1普通水提法

向脱脂并烘干的样品中加入蒸馏水500 mL，置90 ℃水浴恒温浸提2 h，重复一次，7870 g离心20 min，合并2次上清液，减压浓缩至250 mL，加入4倍体积预冷的无水乙醇[7]，4 ℃沉淀24 h后，2490 g离心15 min，将沉淀物冷冻干燥。

1.3.2高温高压水提法

向脱脂并烘干的样品中加入蒸馏水500 mL，置高压灭菌锅中，121 ℃，浸提2 h，重复一次，其余步骤同1.3.1。

1.3.3热碱法

向脱脂并烘干的样品中加入500 mL蒸馏水，50 g NaOH，25 g尿素，搅匀后置65 ℃水浴恒温浸提1 h，7870 g离心20 min，用HCl调pH至中性，减压浓缩至250 mL，按1.3.1的方法用乙醇沉淀后将沉淀物冷冻干燥之后重新溶于水中，7870 g离心20 min，取上清液，再按上述方法醇沉，将沉淀物冷冻干燥即得热碱提水溶性粗多糖。

1.3.4冷碱法

向脱脂并烘干的样品中加入500 mL蒸馏水，50 g NaOH，25 g尿素，搅匀后置4 ℃冰箱中浸提48 h，其余步骤同1.3.3。

1.4粗多糖含量测定

参考《中华人民共和国农业行业标准NY/T16762008食用菌中粗多糖含量的测定》测定不同提取方法得到的提取物中的粗多糖含量[12]，并计算粗多糖得率。

1.5不同提取物对K562细胞的抑制率测定

将4种提取方法得到的提取物分别以RMPI1640培养液溶解，配成2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的溶液。K562细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640中培养，培养条件为37 ℃，5%CO2。每3～4 d进行一次传代。取对数生长期的细胞，用RPMI1640培养液稀释至1×106个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，然后分别加入不同浓度的槐耳提取物100 μL，作用终浓度为1，1.5和2 mg/mL，每种浓度设5个重复。以RPMI1640培养液和细胞为阴性对照，空白对照组为RPMI1640和相应浓度提取物（以消除提取物自身颜色对吸光度的影响）。孵育72 h后置用倒置显微镜观察其形态，加20 μL 5 mg/mL的MTT，4 h后离心（3000 g，15 min）去上清，每孔加入150 μL的DMSO，摇床低速振荡10 min使结晶物充分溶解后于570 nm处检测吸光度并计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率=[1（实验孔吸光值空白对照孔吸光值）/（阴性对照孔吸光值空白对照孔吸光值） ]×100%

宋爱红，等：不同提取方法对槐耳提取物的粗多糖含量及K562细胞抑制作用的影响

2结果与分析

2.1提取物得率、粗多糖含量及粗多糖实际得率计算

由表1中数据可以看出，碱提法的水溶性提取物得率远远高于水提法，其中热碱法提取物得率是普通水提法的14.75倍，冷碱法的得率是普通水提法的12.34倍。热碱提取法的提取物得率虽然最高，但其多糖含量却最低，其中冷碱法的多糖实际得率最高为6.93%。

2.3细胞形态学观察

四种槐耳提取物以不同终浓度（1，1.5，2 mg/mL）作用于K562细胞72 h后对照组细胞密度大，形态完整，圆润透明，而实验组随着药物浓度的增大，可以明显的看到细胞密度变小，受损细胞胞浆浓缩、包膜表面形成突起、体积皱缩与正常细胞脱离，细胞呈碎片状，胞内存在不透明颗粒，而且完整细胞的量明显地减少，呈现出凋亡细胞特有的形态学特征[1315]，说明了槐耳提取物对K562细胞显示出了明显地促凋亡作用。其中热碱提取物浓度为2 mg/mL时（R3），对K562细胞促凋亡作用最强烈，几乎看不到完整的细胞个体存在，同时冷碱提取物对K562细胞的促凋亡作用也是比水提法更明显，这一现象的出现与MTT法的结论是一致的。

3讨论

本研究用4种方法对槐耳（T. robiniophila）子实体进行提取，考察了水溶性提取物中粗多糖含量、粗多糖实际得率和对K562细胞的抑制率。碱提法的粗多糖实际得率远高于水提法，且热碱法提取物浓度为2 mg/mL作用于K562细胞72 h后，抑制率高达92.28%。本实验的碱提法中不仅仅是添加了NaOH而且还添加了尿素，据闵三弟[16]等的研究，用尿素处理茯苓，不但获得较多的水溶性茯苓多糖，而且提高了抗肿瘤活性。Junji Hammro等人认为，尿素处理改变了原茯苓多糖的高级结构，表明抗肿瘤作用的显著差异是由于精细结构的微小变化所造成的。这些研究结果为本研究中为什么热碱提取的多糖含量最低，但其抗肿瘤作用效果最明显的现象提供了可能的解释依据，这一点可以在后续研究中再做进一步的验证实验。

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