MGMT及表皮生长因子受体在喉鳞癌中的表达及对预后的影响

[摘要] 目的 研究探討喉鳞状细胞癌中MGMT及表皮生长因子受体蛋白的表达与临床资料间的关系及其对治疗预后的影响。 方法 标本均选取2016年1月～2017年6月于我院耳鼻喉科手术治疗的93例喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）患者的石蜡切片，经病理学确诊为LSCC标本。选取20例健康喉黏膜组织标本作为对照组。采用免疫组化染色法检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT）与表皮生长因子受体蛋白（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表达水平。评价肿瘤组与对照组之间MGMT、表皮生长因子受体蛋白（EGFR）的表达差异；评价肿瘤组中MGMT、EGFR的表达水平与其各项临床资料间的关系；评价肿瘤组中MGMT与EGFR表达之间的关系。 结果 肿瘤组与对照组之间MGMT、EGFR的表达比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；肿瘤组中MGMT、EGFR的表达水平与病理分期和分化程度呈正相关关系（P<0.05）；肿瘤组中MGMT与EGFR表达呈正相关（P<0.05）。 结论 本次研究证明喉鳞状细胞癌中MGMT、EGFR的表达与病理分期和分化程度呈正相关，MGMT、EGFR的高表达往往意味着肿瘤预后不良且比通过疾病分期预后更为准确。MGMT、EGFR的表达作为LSCC的生物指标值得临床推广。

[关键词] 喉鳞状细胞癌；表皮生长因子；MGMT；预后；免疫组化染色

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）24-0060-04

Expression of MGMT and epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma and its effect on prognosis

SONG Xiaoxiao LIN Renyu

Department of Otolaryngology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of MGMT and epidermal growth factor receptor（EGFR） and clinical data in laryngeal squamous cell carcinoma and its effect on the prognosis of treatment. Methods Paraffin section of 93 cases of Laryngeal squamous cell carcinoma（LSCC） who were treated in the Department of Otolaryngology in our hospital from January 2016 to June 2017 were selected. All the specimens were pathologically confirmed as LSCC specimens. 20 specimen of healthy laryngeal mucosa were selected as control group. The expression of O6-methylguanine-DNA-methyltransferase （MGMT） and epidermal growth factor receptor（EGFR） was detected by immunohistochemical staining. The differences in expression of MGMT and epidermal growth factor receptor（EGFR） protein between tumor group and control group were evaluated. The relationship between MGMT， EGFR expression levels and their clinical data in tumor groups was evaluated. The relationship between MGMT and EGFR expression in tumor groups was evaluated. Results There were significant differences in the expression of MGMT and EGFR between the tumor group and the control group （P<0.05）. The expression levels of MGMT and EGFR in the tumor group were positively correlated with pathological stage and differentiation（P<0.05）. There was a positive correlation between MGMT and EGFR expression in the tumor group（P<0.05）. Conclusion This study demonstrates that the expression of MGMT and EGFR is positively correlated to the pathological stage， differentiation in laryngeal squamous cell carcinoma. The high expression of MGMT and EGFR often means that the prognosis of the tumor is poor and it is more accurate in prognosis than the staging of the disease. The expression of MGMT and EGFR is worthy of clinical promotion as a biological indicator of LSCC.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； Epidermal growth factor； MGMT； Prognosis； Immunohistochemical staining

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是最常见的咽喉恶性肿瘤，也是头颈部第二高发的细胞癌[1]，超过90%的咽喉恶性肿瘤为鳞状细胞癌，而据调查显示，该病在我国发病率仍呈逐年上升趋势。虽然喉鳞状细胞癌被认为与吸烟、饮酒及基因因素有关，但病因至今尚不明确[2]。但这并不影响喉鳞状细胞癌对人体的极大危害，其早期症状为咽后部异物感，肿瘤恶化后可引起吞咽疼痛，后期则极易发生颈部淋巴结痛苦转移并累及咽喉，导致呼吸困难[3]。随着我国医疗技术的发展，手术与放疗对早期喉鳞状细胞癌的治疗已取得较好效果，但该病致死率仍居高不下，这是由于患者自身健康意识不强以及喉鳞状细胞癌的早期症状不够明显，导致确诊时已发展为癌症晚期，错过了最佳治疗时机[4]。因此寻找到能够准确判断喉鳞状细胞癌恶性程度的生物指标是主要研究方向。肿瘤的形成与DNA的损伤密切相关，其中烷化剂对细胞威胁最大。O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT）是能高效修复细胞DNA损伤的酶，其在抵御烷化剂的过程中发挥了重要作用，因此对MGMT的研究是寻找喉鳞状细胞癌预后证据的方向之一[5]。表皮生长因子受体蛋白（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种广泛分布于人体上皮细胞、胶质细胞等细胞表面的糖蛋白，研究表明[6]许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，因此对EGFR表达的研究也是寻找喉鳞状细胞癌预后证据的方向。本次研究对喉鳞状细胞癌中的MGMT及EGFR进行检测，旨在探讨两者的表达及其预后与喉鳞状细胞癌恶性程度的关系，找到早期诊断喉鳞状细胞癌更为有效的生物指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本均选取2016年1月～2017年6月于我院耳鼻喉科手术治疗的93例LSCC患者的石蜡切片，经病理学确诊为LSCC标本。纳入标准：①年龄18～65岁，性别不限；②患者临床资料完整，被检测的肿瘤标本均为石蜡包埋组织；③遵守医学实验伦理学原则，经与患者和家属沟通，其自愿签订知情同意书；④术前6个月内未经放、化疗及免疫治疗。

将LSCC患者设为肿瘤组，18～50岁40例，51～65岁53例；男63例，女30例；发生淋巴结转移40例，未转移53例；参照2015年世界卫生组织（World health organization，WHO）肿瘤组织学分类[5]，将LSCC患者分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期，其中Ⅰ期13例，Ⅱ期23例，Ⅲ期34例，Ⅳ期23例；参照肿瘤组织学，将肿瘤分化程度分为低、中和高三类，其中低分化24例，中分化36例，高分化33例；按浸润程度将LSCC患者分为未及全层和浸润全层两类，其中未及全层41例，浸润全层52例。另选取20例健康状态的喉黏膜标本作为对照组。

1.2 试剂盒

MGMT、EGFR多克隆抗体、二抗和DAB显色试剂盒均购买自北京奥维亚生物技术有限公司，操作严格按照说明书进行。

1.3 免疫组化染色

肿瘤组标本均经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，常规2 μm连续切片，经常规脱蜡至水；3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；之后用蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡5 min；水浴高溫抗原修复；将切片自然冷却至室温，画圈，滴加5%PSA（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加MGMT 1：90、EGFR 1：90的一抗工作液，37℃孵育1～2 h；PBS洗5 min，3次；滴加MGMT 1：100、EGFR 1：100的生物素标记二抗，室温静置30 min；PBS洗5 min，3次；使用现配的DAB显色液（B：C=1：50）显色10 min；自来水充分冲洗，Mayer苏木素复染30 s，盐酸酒精分化3 s，自来水充分冲洗，脱水，乙酸2 min，乙醇梯度由低至高各2 min，二甲苯5 min，中性树胶封片。

1.4 免疫组化结果分析

MGMT蛋白正常染色结果为镜下细胞核呈蓝色，阳性呈深浅不一的棕色，EGFR蛋白正常染色结果为镜下细胞膜呈蓝色，阳性呈深浅不一的棕色。按照阳性着色细胞评分法，随机选取10个不同视野，在×400倍光学显微镜下按着色程度：0分无着色，1分淡黄色，2分浅棕色，3分深棕色。阳性范围：1分<20%，2分20%～50%，3分51%～75%，4分>75%，二者相乘的积≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.5 观察指标

比较两组喉部组织标本MGMT的阳性检出率，比较两组喉部组织标本EGFR的阳性检出率，并进一步比较肿瘤组喉部组织标本MGMT与EGFR的阳性率和临床资料的关系。阳性检出率=检出阳性例数/本组总例数×100%。

1.6 统计学方法

所有统计学资料都采用SPSS21.0专业统计学软件进行数据分析，所有的组间正态性计数资料以[n（%）]表示，用χ2检验，连续变量的相关性分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 两组MGMT与EGFR表达比较

肿瘤组与对照组MGMT表达水平比较，肿瘤组呈阳性表达的例数明显高于对照组（P<0.05）；肿瘤组与对照组中EGFR表达水平比较，肿瘤组呈阳性表达的例数明显高于对照组（P<0.05）。见表2。

2.2腫瘤组MGMT与EGFR表达水平和临床一般资料间的关系

肿瘤组MGMT与EGFR的表达水平经比较，在年龄、性别、淋巴结转移情况和浸润程度方面，差异无统计学意义（P>0.05），而在分化程度方面，差异具有统计学意义（P<0.05），且分化程度越高，与表达水平的关系越密切（P<0.05）。见表3。

2.3肿瘤组MGMT与EGFR间的相关性分析

肿瘤组在MGMT阳性表达的例数中，EGFR表达为阳性的概率为92.308%，MGMT阴性表达的例数中，EGFR表达为阴性的概率为64.286%，差异具有统计学意义（P<0.05），对所有样本MGMT与EGFR相关性分析得出，肿瘤组MGMT与EGFR呈正相关（r=0.105、0.243，P<0.05）。

3 讨论

喉鳞状细胞癌的病因虽尚不清楚，因此提高诊断的准确性与预后的灵敏性，在治疗LSCC中具有重要地位[7]。研究表明[8]，通过对早期喉鳞状细胞癌患者进行放、化疗或手术治疗，均使患者病情得到明显改善，因此除了医疗技术的改善来提高治疗LSCC的成功率外，通过提高对早期LSCC的诊断准确率以及得到灵敏性高的预后指标也是重要研究方向。在传统的诊断与预后方法中，主要以间接喉镜检查咽喉部位有无肿瘤病变症状[9]，在疑似病变时配合CT检查确定肿瘤范围，效果并不是很理想，而预后也多以单一炎症因子或肿瘤坏死相关因子作为指标，由于干扰因素多所以灵敏性不高。而以MGMT与EGFR作为生物指标，在检查出疑似病变或常规体检中，即可更准确的确诊病情，找到更明确的治疗预后，制订出对应的治疗方式[10]。

癌症形成的重要步骤即为烷化剂对DNA分子的烷基化，导致DNA配对错位而封闭DNA复制[11]。MGMT可以通过消耗酶而在突变发生以前把烷化基因转移到自身，使DNA损伤得到修复[12]。本次研究结果显示，肿瘤组的MGMT表达水平明显高于对照组，且与病理分期和分化程度呈正相关关系，可能是因为，对照组为正常喉部黏膜组织标本，细胞DNA没有发生大量烷基化突变，因此不能触发MGMT的生成信号，而肿瘤组DNA分子烷基化损伤严重，MGMT作为自杀蛋白在将烷基化转移自身后，启动子区域甲基化，使其表达沉默[13]。这种内部信号，诱导了ada基因的转录与翻译，产生新的MGMT，以补充细胞内因消耗而显不足的MGMT[14]。而且根据对MGMT表达的研究，其在宫颈癌、食管癌、肺癌等不同模式中呈现不同模式，而根据病变部位喉部，癌症中只有可能是属于吼鳞癌胶质瘤的高表达[15]。这也可能是出自机体自我保护意识为了应对肿瘤的形成而释放的信号，确切的MGMT生成机制尚不十分清楚[16]。EGFR在细胞生理过程中发挥重要的调节作用，是细胞增殖和信号传导的受体，而肿瘤在细胞增殖上表现的活性远远高于正常细胞，因此EGFR的突变或过表达往往会引发肿瘤[17]。本次研究结果显示，肿瘤组的EGFR表达水平明显高于对照组，且与病理分期和分化程度呈正相关关系。这可能是因为EGFR的高表达主要与其基因扩增有关，引起下游信号传导增强[18]。而EGFR的信号传导具有多重调节作用，加之EGFR受体某些结构域的缺失使得受体下调机制的破坏，导致EGFR持续活化，EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖[19]，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良。而与病理分期、分化程度的正相关则是因为，EGFR还与血管生成有关，EGFR促进血管生成，为肿瘤的增殖分化提供了充足的生物组织环境，因此在分期高的病例中，血管密集度往往较高，EGFR表达水平自然更高[20]。因为肿瘤形成的复杂性，在因EGFR高表达引起的肿瘤形成，接着产生的MGMT的高表达，间接证明二者的正相关关系。

综上所述，本次研究证明喉鳞状细胞癌中MGMT、EGFR的表达与病理分期和分化程度呈正相关关系，MGMT、EGFR的高表达往往意味着肿瘤预后不良且比通过疾病分期更为准确。MGMT、EGFR的表达作为LSCC的生物指标值得临床推广。

[参考文献]

[1]黄显聪，赵强，凌志强，等.EGFR mRNA上调在食管鳞状细胞癌患者预后预测中的意义[J].肿瘤学杂志，2016， 22（3）：199-204.

[2]管袁夏子，李明焕.表皮生长因子受体和P53与食管鳞状细胞癌放疗敏感性的关系[J].国际免疫学杂志，2016， 39（5）：446-450.

[3]Higgins GS，Krause M，Mckenna WG，et al. Personalized radiation oncology：Epidermal growth factor receptor and other receptor tyrosine kinase inhibitors[J].Recent Results Cancer Res，2016，198（14）：107-122.

[4]Mok TS，Geater SL，Su WC，et al.A randomized phase 2 study comparing the combination of ficlatuzumab and gefitinib with gefitinib alone in asian patients with advanced stage pulmonary adenocarcinoma[J].Journal of Tho-racic Oncology，2016，11（10）：1736-1744.

[5]张坤宁，路军，赵宏颖，等. 表皮生长因子受体、人类表皮生长因子受体2、人类表皮生长因子受体3表达与非小细胞肺癌预后的关系[J]. 肿瘤研究与临床，2016，28（2）：73-77.

[6]孙珠蕾，杨德生，张蕾蕾，等. 骨桥蛋白与表皮生长因子受体、PI3 K蛋白在食管鳞癌中的表达及临床意义[J].中国医刊，2015，5（4）：54-59.

[7]Minami T，Kijima T，Kohmo S，et al.Overcoming chemoresistance of small-cell lung cancer through stepwise HER2-targeted antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and VEGF-targeted antiangiogenesis[J].Scientific Reports，2016，3（9）：2669-2669.

[8]Lubner SJ，Uboha NV，Deming DA.Primary and acquired resistance to biologic therapies in gastrointestinal cancers[J].J Gastrointest Oncol，2017，8（3）：499-512.

[9]柳菁菁，張爽，吴春娇，等.中国不同表皮生长因子受体敏感突变类型非小细胞肺癌患者接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂一线治疗的临床疗效比较[J].中华肿瘤杂志，2016，38（3）：211-217.

[10]符征，汪吉宝.喉鳞状细胞癌中表皮生长因子受体的表达与临床病理特征的关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2017，12（4）：147-149.

[11]Spitzwieser M，Holzweber E，Pfeiler G，et al. Applicability of HIN-1， MGMT， and RASSF1A，promoter methylation as biomarkers for detecting field cancerization in breast cancer[J]. Breast Cancer Research Bcr，2015，17（1）：1-13.

[12]Raizer JJ，Giglio P，Hu J，et al. A phase Ⅱ study of bevacizumab and erlotinib after radiation and temozolomide in MGMT unmethylated GBM patients[J]. J Neurooncol，2016，126（1）：185-192.

[13]詹娜，徐威，董卫国，等.赫赛汀对过表达人类表皮生长因子受体-2食管鳞癌细胞株的作用[J].中华实验外科杂志，2016，33（9）：2158-2162.

[14]张静，田甜，刘静，等.表皮生长因子促进子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa增殖[J].基础医学与临床，2017，37（4）：488-492.

[15]Inda MM，Bonavia R，Mukasa A，et al.Tumor heterogeneity is an active process maintained by a mutant EGFR-induced cytokine circuit in glioblastoma[J].Genes Dev，2015，24（16）：1731-1745.

[16]Kale AD，Charantimath S.HER2，TOP2A，CCND1，EGFR and c-MYC oncogene amplification in colorectal cancer[J].Journal of Clinical Pathology，2015，60（60）：768-772.

[17]Sakashita T，Homma A，Hatakeyama H，et al.Clinical outcomes of weekly cisplatin chemoradiotherapy for patients with pyriform sinus cancer[J].Int J Clin Oncol，2015， 20（6）：1081-1085.

[18]Cata JP，Zafereo M，Villarreal J，et al.Intraoperative opioids use for laryngeal squamous cell carcinoma surgery and recurrence：A retrospective study[J].J Clin Anesth，2015，27（8）：672-679.

[19]Killock D.Gastrointestinal cancer：PICCOLO--changing the tune of anti-EGFR therapy[J].Nat Rev Clin Oncol，2016，13（4）：202-203.

[20]Siegal T.Clinical relevance of prognostic and predictive molecular markers in gliomas[J].Adv Tech Stand Neurosurg，2016，（43）：91-108.

（收稿日期：2018-04-21）