塞来昔布对不同激素受体乳腺癌细胞的放疗增敏作用的初步研究

[摘要] 目的 对选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对不同激素受体乳腺癌细胞的放疗增敏作用进行初步探讨。 方法 取指数生长期的不同激素受体乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，分为对照组、药物组、照射组和实验组（射线+塞来昔布），利用CCK-8实验测定细胞活性，Transwell实验观察细胞侵袭能力变化，细胞克隆形成实验检测放射增敏作用。 结果 在一定浓度范围内，塞来昔布可抑制两种细胞的活性，且抑制效应呈量效关系，塞来昔布还能抑制细胞侵袭能力。塞来昔布与X射线联用可显著降低两种细胞的存活分数，在2 Gy照射时最为显著。 结论 塞来昔布对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231有显著的放射增敏作用，且能抑制两种细胞的侵袭能力，其机制有待进一步研究。

[关键词] 塞来昔布；乳腺癌细胞；放射治疗；雌激素受体

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（b）-0080-03

放射治疗是乳腺癌的重要治疗手段。但是，在现有的放疗条件下，进一步优化射线物理剂量的分布已经十分有限，联合辐射增敏药物可能是提高放疗疗效的较好选择。选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布毒性小，且其联合化疗药物在对结肠癌、肺癌、乳腺癌的体外和在体研究中取得良好的效果，联合放疗也有少量报道[1-5]，但有关塞来昔布对不同雌激素受体的乳腺癌细胞的放射增敏作用尚未见报道，本实验研究对这方面进行了初步探讨，为进一步阐明机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7与MDA-MB-231细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供；用含有10%的胎牛血清（杭州四季青公司产品）的RPMI-1640培养基（Gibco BRL公司），于37°C、5%CO2、95%湿度CO2培养箱进行培养。待细胞呈对数生长，即用0.25%的胰蛋白酶（Gibco BRL公司）消化，传代。

1.1.2 主要试剂及仪器 塞来昔布为美国辉瑞公司产品；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；Matrigel胶为美国BD公司产品；Transwell板为美国Corning公司产品；其他仪器包括流式细胞仪、直线加速器（瑞典医科达公司）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞照射 直线加速器垂直照射，剂量率200 cGy/min，照射野10 cm×10 cm，源皮距为100 cm，六孔板底垫有1.5 cm厚的补偿膜，以消除建成效应。

1.2.2 CCK-8实验 MCF-7和MDA-MB-231细胞分别接种6×103个/孔和5×103个/孔于96孔板中，培养24 h左右，使细胞贴壁生长；塞来昔布终浓度为0、10、20、30、40、50、100、200 μmol/L，复孔6个，换新鲜无血清培养基加于细胞孔中，分别培养24 h和48 h；培养结束前2 h，加入CCK-8试剂，10 μL/孔，反应2 h，检测OD450。

1.2.3 Transwell侵袭实验 塞来昔布浓度分别为0、20、50 μmol/L，作用于处于对数生长期的MCF-7和MDA-MB-231细胞，37℃，24 h；实验前1 d将Matrigel胶置于4℃使之溶解；Transwell板一孔的上室内加入30 μL（Matrigel∶PBS=1∶4）稀释胶，37℃，3 h；MCF-7和MDA-MB-231细胞分别5×104个/200 μL加于已经铺胶的上室中，下室内加入10% FBS 1640培养液600 μL；37℃，18～24 h；吸取上清，棉签仔细去除上室内残留的细胞和Matrigel；70%甲醇，300 μL/孔，固定30 min；PBS洗涤，3 min/次，3次；苏木素，300 μL/孔，染色10 min；双蒸水洗涤，3 min/次，3次；镜下计数细胞个数。

1.2.4 细胞克隆形成实验 分塞来昔布组、单纯辐射组和辐射联合塞来昔布组，设0、1、2、4、6 Gy五个辐射计量点。MCF-7和MDA-MB-231细胞接种于六孔板中，塞来昔布浓度分别为0、20 μmol/L，置于37℃培养24 h；然后接受照射，照射后，将细胞置于37℃培养24 h后换新鲜10% FBS 1640培养液继续培养，根据细胞克隆生长情况培养10～14 d；克隆固定：倾倒出培养基，PBS轻轻冲洗2次，70%甲醇固定15 min，吸去多余的甲醇，晾干；Giemsa染色20 min，双蒸水轻轻冲洗2次，吸去多余的水，晾干，计数肉眼可见的细胞克隆数（集落数）（≥50个细胞/集落），重复3次。根据公式：克隆数/接种细胞数×100%来计算生存率，利用LQ模型拟合生存曲线。

1.3 统计学方法

数据统计使用SPSS 13.0软件。多组间数据比较使用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。协同效应的判定使用金氏公式，即：Q=EA+B/（EA+EB-EA×EB）。其中，EA+B为实测合并效应，EA为单纯照射效应，EB为单纯药物效应，Q值在0.85～1.15为单纯相加效应，1.15～20.00为增强效应，>20为显著增强效应。

2 结果

2.1 CCK-8实验

CCK-8实验显示，塞来昔布能有效抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的活性，随药物浓度的增加和作用时间的延长，MCF-7和MDA-MB-231的活性逐渐下降，且两种细胞间受抑制程度有差异。考虑到之后的放疗增敏实验，塞来昔布的浓度选择为20 μmol/L。见表1。

2.2 细胞侵袭实验

侵袭实验显示，塞来昔布能较有效地减少乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的侵袭能力。统计学检验表明，塞来昔布对两种细胞的侵袭能力抑制程度在20 μmol/L和50 μmol/L差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.3 克隆形成实验检测放疗增敏作用

细胞克隆形成实验结果显示，塞来昔布能增强射线对乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆源性存活的抑制，金氏公式表明，在20 μmol/L塞来昔布联合2 Gy射线时对两种细胞的增敏作用均达到最强。见图2、表2、3。3 讨论

环氧合酶（cyclooxygenase，COX）是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，存在COX-1和COX-2两种同工酶，研究表明，COX-2的表达与人类多数肿瘤关系密切，它参与了肿瘤细胞的转化、生长、凋亡过程，同时也参与细胞的运动、转移、肿瘤新生血管的形成[6]；塞来昔布联合放射线、化疗药物，可提高肺癌等多种肿瘤细胞的放化疗疗效[7]，但机制尚不完全明了。有研究证实，塞来昔布虽然是COX-2的高选择性抑制剂，但并不是完全通过抑制COX-2而起作用的，抑制肿瘤细胞核内的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）也是重要的途径之一[8]。而在乳腺癌患者中，雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性和阴性的群体，预后有较大的区别，同时有研究表明，ER阳性细胞也有激素治疗抵抗的情况，其原因可能与EGFR关联的信号网络引起的ER信号通路的独立激活有关[9]。因此本研究选择了ER阳性（MCF-7）和阴性（MDA-MB-231）两种细胞，以探讨不同的ER状态与塞来昔布可能引起的放疗增敏效果是否有关，为实际临床治疗提供更完备的信息。

CCK-8细胞活性研究结果表明，塞来昔布对两种细胞的活性在多数浓度下，都有抑制作用，且随着剂量的增大，作用时间延长，抑制作用不断增强。但是在20 μmol/L的浓度下，作用24 h，MCF-7细胞的活性反而出现增加，与MDA-MB-231细胞不同；有趣的是，在放疗后的克隆形成实验中，20 μmol/L的塞来昔布作用24 h，接受2 Gy X线照射后，两种细胞均显示出最大的放疗增敏作用，且MCF-7的增敏作用显著大于MDA-MB-231细胞（金氏公式Q值：30.777）。其机制可能是：抑制肿瘤细胞的活性，并不代表肿瘤细胞的生存受到影响，且判断肿瘤细胞是否被杀灭，需要观察其是否失去永久分裂能力，因此克隆形成实验才是检验肿瘤细胞是否被杀灭的标准实验。塞来昔布抑制两种细胞活性的信号通路可能与塞来昔布引起放疗增敏不同，且ER受体状态如何影响塞来昔布引起放疗增敏的能力，均有待进一步研究。

此外，肿瘤细胞的远处转移，是肿瘤治疗失败最常见的因素之一，而放射治疗是一种局部治疗，放疗后，部分肿瘤细胞可能出现侵袭、迁移能力的增加，可能与射线能诱导血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表达有关[10]。牛国梁等[10]的研究表明，塞来昔布联合放射线能显著降低VEGF的表达。本研究发现，塞来昔布单独使用即可对两种肿瘤细胞的侵袭能力产生抑制作用，且随着剂量的增加，抑制作用逐渐增强。统计计算表明，两种细胞在塞来昔布的两个浓度下侵袭力受抑制的程度没有显著差异，表明塞来昔布在抑制肿瘤细胞侵袭能力上，不受ER受体状态影响。

总之，本研究证实了塞来昔布对人乳腺癌细胞的MCF-7和MDA-MB-231有显著的放射增敏作用，在2 Gy时抑制作用最大，且塞来昔布单独使用能抑制两种细胞的侵袭能力，其机制均有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Kuipers GK，Slotman BJ，Wedekind LE，et al. Radiosensitization of human glioma cells by cyclooxygenase-2（cox-2）inhibition：independent on cox-2 expression and dependent on the cox-2 inhibitor and sequence of administration [J]. Int J Radiat Biol，2007，83（10）：677-685.

[2] Raju U，Ariga H，Dittmann K，et al. Inhibition of DNA repair as a mechanism of enhanced radioresponse of head and neck carcinoma cells by a selective cyclooxygenase-2 inhibitor，celecoxib [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2005，63（2）：520-528.

[3] Handrick R，Ganswindt U，Faltin H，et al. Combined action of celecoxib and ionizing radiation in prostate cancer cells is independent of pro-apoptotic bax [J]. Radiother Oncol，2009，90（3）：413-421.

[4] Bundred NJ，Barnes NL. Potential use of cox-2-aromatase inhibitor combinations in breast cancer [J]. Br J Cancer，2005，93（Suppl 1）：10-15.

[5] Doll CM，Winter K，Gaffney DK，et al. Cox-2 expression and survival in patients with locally advanced cervical cancer treated with chemoradiotherapy and celecoxib：a quantitative immunohistochemical analysis of rtog c0128 [J]. Int J Gynecol Cancer，2013，23（1）：176-183.

[6] Grosch S，Maier TJ，Schiffmann S，et al. Cyclooxygenase-2（cox-2）-independent anticarcinogenic effects of selective cox-2 inhibitors [J]. J Natl Cancer Inst，2006，98（11）：736-747.

[7] 熊建萍，陶庆松，张凌，等.Cox-2抑制剂联合顺铂或X射线对a549肺腺癌细胞株的体外实验[J].肿瘤防治研究，2007，34（1）：8-10.

[8] Dittmann KH，Mayer C，Ohneseit PA，et al. Celecoxib induced tumor cell radiosensitization by inhibiting radiation induced nuclear egfr transport and DNA-repair：a cox-2 independent mechanism [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008，70（1）：203-212.

[9] Osborne CK，Shou J，Massarweh S，et al. Crosstalk between estrogen receptor and growth factor receptor pathways as a cause for endocrine therapy resistance in breast cancer [J]. Clin Cancer Res，2005，11（2 Pt 2）：865-870.

[10] 牛国梁，王辉，谢荣俊，等.选择性cox-2抑制剂塞来昔布对乳腺癌的放疗增敏作用及其机制研究[J].肿瘤学杂志，2011，17（3）：172-176.

（收稿日期：2012-12-27 本文编辑：张瑜杰）