外翻肠囊法研究扶正消症方中黄连碱类在大鼠肠内的吸收

材料

岛津LC 20A高效液相色谱仪（SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站）；ALC-M Tissue-Organ Bath System外翻肠囊装置；ALC-CWB数控恒温循环水槽（上海奥尔科特生物科技有限公司）；DL6MB大型冷冻离心机（长沙英泰仪器有限责任公司）；XS205型1/10万天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；BF-2000氮气吹干仪；PSAN-8氮气发生器（北京中惠普分析技术研究所）；SK-1快速混匀器（金坛市华城恒磊实验仪器厂）；混合氧气（95%氧气，5%二氧化碳）。

盐酸小檗碱（纯度>99%，上海源叶生物科技有限公司，批号YY20110520）；戊巴比妥钠（北京普瑞斯生物科技有限公司，Lot NO：090205）；扶正消症方提取物（自制，批号20150105）；蒸馏水（屈臣氏）；甲醇，乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）；其他试剂为分析纯。

SPF级雄性SD大鼠，200～250 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（军）2012-0004。

2 方法与结果

2.1 Tyrode缓冲液的配制

按照文献[9]配制，并用Tyrode液分别配制质量浓度为5，10，15 g·L^-1的药液（内含0.65%十二烷基硫酸钠）作为供药体系。

2.2 FZ提取物的制备

6倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，60 ℃减压回收乙醇至稠膏状，60 ℃真空干燥即得。根据2015年版《中国药典》黄连含量测定项下条件，以盐酸小檗碱对照品为对照，经HPLC检测，提取物中小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀的质量分数分别为4.88%，0.53%，1.00%，1.33%。

2.3 FZ提取物大鼠肠吸收实验含量测定方法的建立

2.3.1 色谱条件 Welch Ultimate XB-C¹⁸色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，B为乙腈-0.05 moL·L^-1磷酸二氢钾溶液（每100 mL加入十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调pH 4.0，20∶50），A-B 30∶70；检测波长345 nm；流速1 mL·min^-1；柱温30 ℃。

色谱峰的定位^[10]：根据2015年版《中国药典》黄连含量测定项下条件，以盐酸小檗碱对照品的保留时间为对照，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间来确定表小檗碱、黄连碱、巴马汀的峰位，其相对保留时间与药典规定一致。

2.3.2 专属性试验 比较肠囊中空白台氏液、外翻肠囊生物样品、FZ提取物溶液及对照品溶液的色谱行为，结果见图1，目标峰位置无干扰，方法建立的专属性较好。

2.3.3 对照品溶液的制备及线性关系考察 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加台氏液配制成不同浓度的对照品溶液，质量浓度分别为0.012，0.122，1.22，4.86，24.29，60.72，101.2 mg·L^-1。 进样20 μL，记录色谱图和峰面积，以峰面积对进样量（ng）进行线性回归，得回归方程和相关系数，y=3 523x+5 724，r=0.999 9，标准曲线在4.88～1 012 ng线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 按2.2.3项下方法，分别取高、中、低3个浓度的对照品溶液，每个浓度重复进样5次，计算日内精密度，盐酸小檗碱在0.122，4.86，24.29 mg·L^-1下RSD分别为4.1%，0.48%，2.2%；上述各浓度对照品连续测定3 d，计算日间精密度，RSD分别为3.5%，3.5%，1.4%，表明仪器的精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 分别取同一样品溶液，在室温存放0，4，8，10，16，24 h进样测定，峰面积的RSD小于5.0%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液9份，分别精密加入高、中、低小檗碱对照品溶液适量，在2.2.1项色谱条件下进样分析，高、中、低浓度的平均回收率为96.67%，96.70%，103.5%；RSD分别为0.67%，0.27%，0.40%，见表1，符合生物样品分析要求。

2.4 大鼠外翻肠囊模型实验

2.4.1 大鼠的外翻肠囊实验 大鼠15只（各剂量组5只），实验前12 h禁食不禁水，以0.005 mL·g^-1的0.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待大鼠失去知觉后固定，沿腹中线打开腹腔约3 cm，截取空肠（距幽门约10 cm处开始）和回肠（近盲肠小端侧肠管10 cm处开始）置于Tyrode液（冰浴）中，小心剥离大鼠肠管肠系膜，并洗净肠管内容物，将肠管一端结扎于硅胶软管，小心翻转后再将肠末端结扎，置于恒温37 ℃并已经供氧的浴管中，向肠管中注射2 mL Tyrode液，观察肠管是否充盈完整无破损，平衡约5 min后将浴管中Tyrode液替换为适宜浓度的药液，分别在15，30，45，60，90，120 min取样400 μL，同时补充等体积的37 ℃台氏液，实验结束后，将肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量长度和宽度，记录吸收面积a。将收集好的样品氮气吹干，加甲醇200 μL溶解，移取上清液，过0.22 μm滤膜后进行HPLC检测。

2.4.2 数据处理 按下式计算小檗碱、表小檗碱、巴马汀和黄连碱在各个时间点的累积吸收量（Q）。

Q=0.2×Cⁿ×V^平衡V^样+0.2∑n-1i=1Ci

Q为药物各时间的累积吸收量，Cⁿ为各时间点取样的实际检测浓度，V^平衡为平衡前肠管中加入的台氏液体积，V^样为每次取样的体积。

以药物的累积吸收量对时间进行线性回归，得斜率（K），除以吸收面积（a）得到吸收速率常数（K^a，μg·h^-1·cm^-2），公式如下。

Ka=KA

数据以±s表示，用SPSS 20.0对数据进行分析，各组间数据比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.5 肠外翻实验

2.5.1 不同浓度FZ提取物中各生物碱成分在空肠和回肠中累积吸收量的比较 小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱在不同浓度时均可吸收进入肠囊，且4种成分在各肠段均为线性吸收，见表2，相关系数r均达到0.9以上，符合零级吸收速率，见图2；不同浓度下各生物碱成分在回肠中的累积吸收量均高于空肠；在低浓度时，各成分累积吸收量由大到小依次为小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱，这与FZ提取物中含量小檗碱﹥巴马汀﹥黄连碱﹥表小檗碱的结果是一致的，但是在中、高浓度时，表小檗碱的累积吸收量要高于黄连碱，说明FZ提取物经小肠吸收后，所含4个生物碱类成分的比例发生改变，且受到给药浓度的影响，结果见表3。

2.5.2 不同浓度FZ提取物中4种成分在空肠和回肠中K^a的比较 在回肠内，小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱4种成分，中剂量组和高剂量组的吸收速率比较没有统计学差异，低剂量组的吸收速率同中、高剂量组比较明显降低且在统计学上有显著性差异（P<0.05），即中、高剂量时4种生物碱的转运速度与浓度无关，符合主动吸收特征，低剂量给药时转变为一级速度过程，符合被动吸收特征，从药物浓度和吸收速率的关系推测为主、被动同时存在的吸收方式。空肠中4种成分的吸收方式与回肠一致，二者无显著差异，表明这4种生物碱在各个肠段均有吸收，无特定吸收窗，结果见表4。

3 讨论

3.1 药物体外吸收生物模型的选择

中药复方多是口服给药，其有效成分必先经过肠道吸收，入血后再向体内各个组织器官分布，在特定时间和作用部位发挥药效。本研究采用的外翻肠囊法为目前较常用的体外肠道吸收生物模型，其优点是操作简单、快捷，药物用量较少，且保持了完整的组织和黏膜特性；但缺点在于肠囊内为药物吸收的累积量，只有吸收相而没有药物的消除相，故只能单纯的分析药物的吸收机制，但通过了解药物的肠道吸收机制和吸收部位，也可为提高药物生物利用度、确定药物剂型、新药筛选、研究药物代谢动力学等提供参考。

3.2 FZ提取物中各生物碱成分的肠吸收特征

实验结果表明，小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱在小肠中的吸收特征极为相似，推测可能是由于4个生物碱都属季胺类，有相同的母核所致。4种生物碱在15 min内均可进入空肠和回肠，在剂量较低的情况下各生物碱的转运速度随着剂量增加而逐渐升高，当剂量增加到一定程度，各生物碱的转运速度不再呈现浓度依赖性，推测4种生物碱的吸收方式为主、被动同时存在，并且各生物碱在回肠中的吸收量要高于空肠，这与文献[11]的黄连提取物中小檗碱及巴马汀空肠吸收大于回肠的结论存在一定差异，提示方中其他药味可能会影响黄连生物碱类成分的吸收，有待进一步深入研究。

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[责任编辑 曹阳阳]