纳豆芽胞杆菌Bacillus,natto菌剂载体的筛选

摘 要：为研制纳豆芽胞杆菌固体菌剂的制备工艺，以活菌数为指标，考察不同载体，配比，干燥温度等因素对固体菌剂有效活菌数的影响。结果表明：温度37℃，转速150 r·min-1，摇床上进行吸附60 min后，最优吸附载体为麦饭石，最适吸附比例为1∶1，干燥温度40℃，初始有效活菌数达1.09×109 CFU·g-1，最适保藏温度25℃，保藏6个月后仍有2.9×108 CFU·g-1，活菌数残留率为20.2%。同时，麸皮、豆粕、玉米粉可为菌剂提供营养，有利于固体菌剂的长期保藏。

关键词： 纳豆芽胞杆菌； 菌剂； 载体； 麦饭石； 吸附作用

中图分类号：Q 939.96文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）10-1104-04

Selection of Carrier for Dried Bacillus natto

CHEN Longjun， LIN Chenqiang， ZHANG Hui， CHEN Jichen*

（Soil and Fertilizer Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract：Preparation of a dried Bacillus natto product was studied. The carrier material， mixing ratio， and drying temperature for the making were evaluated according to the survival rate of B. natto in the dried product. The optimal process was determined to be stirring the bacterial solution with quartz monzonite as the adsorbent carrier in a mixing ratio of 1∶1 at 150 r·min-1 and 37℃ for 60 min in a container prior to dehydration at 40℃. The dried product had a bacterial count of 1.09×109 CFU·g-1. After 6month storage at 25℃， the count decreased by 20.2% to 2.9×108 CFU·g-1. Inclusion of wheat bran， soymeal and/or corn meal in the mix would provide nutrients for B. natto resulting in aprolonged shelf life of the dried product.

Key words：Bacillus natto； dried bacteria； carrier； quartz monzonite； adsorption

微生物菌剂在废水处理、发酵工业、土壤修复、固体堆肥发酵、微生物菌肥、水产养殖业等[1-4]方面有着广泛的用途。利用液体发酵技术生产液态微生物菌剂具有机械化和自动化程度高、操作工艺容易控制、培养周期短、生产效率高、微生物活性高等优点，但也存在保藏时间短、储藏和运输不方便等缺点。固体菌剂与液体菌剂相比，物理、化学稳定性好，保藏周期长，运输便利等优点。吸附法是一种廉价、有效的微生物固定化方法，利用载体的多孔性、比表面积大的优点来吸附液态发酵的微生物菌剂，是一种新的固体微生物菌剂生产方式。目前用于微生物菌剂的载体包括有机载体和无机载体，如蛭石、草炭、沸石、活性炭、硅藻土、菌糠、玉米粉、豆粕等，不同的载体，性能不一，根据不同的菌剂，吸附效果不同。因此，选择合适的载体至关重要。王微等[5]利用硅藻土作为吸附剂，获得了性能较好的微生物菌剂；赵旭等[6-7]研究了谷糠、炉渣等作为功能性微生物载体的可行性。麦饭石是一种对生物无毒、无害并具有一定生物活性的复合矿物，具有海绵状多孔性、巨大表面积等优点，吸附能力极强，在重金属吸附[8]、水处理[9]等均有研究与应用。但目前将其用于菌剂吸附方面的研究鲜见报道。

因此本研究以麦饭石为主要吸附载体，同时筛选玉米粉、麩皮、活性炭、豆粕等作为吸附载体，进行功能微生物纳豆芽胞杆菌Bacillus natto液体菌剂的吸附研究，对载体种类、吸附比例、干燥温度、保藏条件及保藏期等进行优化，以固化菌剂有效活菌数为指标，筛选出价廉、易得、固化效果好的菌剂载体及其制备工艺，以期为纳豆芽胞杆菌固体菌剂的规模化生产与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 微生物菌剂

纳豆芽胞杆菌Bacillus natto）由福建省农业科学院土壤研究所分离保藏。

1.1.2 菌剂吸附载体

麦饭石、玉米粉、麸皮、活性炭、豆粕等载体由福建省华龙饲料有限公司提供，经本研究所加工粉碎后，再经0.4 mm筛网分筛。

载体无菌处理：试验过程所用载体均经121℃，高温高压灭菌30 min后，烘干备用。

1.1.3 培养基

液体发酵培养基：葡萄糖15 g·L-1、大豆蛋白胨10 g·L-1、（NH4）2SO4 5 g·L-1、Na2HPO4 1 g·L-1、NaH2PO4 1 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、FeCl2 0.02 g·L-1、MgCl2 0.2 g·L-1、MnCl2 0.15 g·L-1和CaCl2 0.2 g·L-1，初始pH 7的培养基，培养温度37℃，接种量4%。

固体培养基：蛋白胨 10 g·L-1，牛肉膏 10 g·L-1，酵母粉 5 g·L-1，琼脂 15～20 g·L-1。采用平板菌落计数法检测有效活菌数。

1.2 试验方法

1.2.1 菌剂液体发酵

纳豆芽胞杆菌经活化后，按2%接种量接种到液体发酵培养基中，37℃、150 r·min-1 条件下进行发酵培养24 h，备用。

1.2.2 不同载体吸菌量比较

无菌条件下，准确称取吸附载体（麦饭石、玉米粉、麸皮、活性炭、豆粕）100 g，分别与100 mL菌液按1∶1（g·mL-1）的比例进行混合，封上六层纱布扎紧，于温度37℃，转速150 r·min-1摇床上进行混匀吸附60 min。置于恒温烘箱中，开启鼓风机，40℃下恒温干燥至衡重，得纳豆芽胞杆菌固体粉剂；取少量固化菌剂于105℃烘干至恒重，测定其含水量。

有效活菌数检测：采用平板计数法，分别称取上述不同载体固体菌剂1 g，用无菌水进行逐级稀释，涂布板，测定其有效活菌数；每个样品重复3次，3次测得的总菌数除以载体质量，即为单位载体的吸菌量。

1.2.3 载体与菌液吸附比例优化

以筛选出的最适载体，通过不同的比例（0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1）与菌液混合，于温度37℃，转速150 r·min-1摇床上进行震荡吸附60 min，每个处理3次重复，干燥完毕后，分别对4种不同比例处理的初产品进行取样，检测活菌体数，考察最适吸附比例。

1.2.4 干燥温度对初产品有效活菌数的影响

载体与发酵菌剂以1∶1的质量体积比进行吸附，分别在不同温度（40、50、60、70、80℃）下，干燥24 h，每个处理3次重复，干燥完毕后，对分别获得的初产品进行取样，检测活菌体数。

1.2.5 菌剂保藏期及保藏条件对有效活菌数的影响

将干燥后的固化菌剂分装于灭菌的蓝盖瓶中，分别在低温（4℃）和常温（25℃）进行密闭保藏。使用固体培养基采用平板菌落计数法进行活菌数量检测，分别测定固化菌剂的起始活菌量和不同保藏时间（14、30、60、90、120、150、180 d）下的活菌量，以检测不同温度、不同时间下的菌剂保藏效果。

2 结果与分析

2.1 不同载体对菌剂的吸附效果

由表1可知，5種载体经吸附干燥后，通过有效活菌数检测，吸菌率最高的为麦饭石，达到93.2%，最低的为豆粕，仅67.9%的吸菌率；同时，经方差分析发现，无机载体与有机载体吸附效果存在显著性差异，无机载体（麦饭石、活性炭）平均吸菌率为90.2%，明显高于有机载体（麸皮、玉米粉、豆粕）的70.1%。这可能是由于无机载体具有较大的比表面积和孔隙度[10]，有利于对菌剂的快速吸附。进一步对含水量进行检测，结果显示5种固化菌剂的含水量比较接近，都在 9%～10%。固化菌剂较低的含水量在一定程度上有利于其中的菌剂存活。2.2 菌剂最优吸附比例

以麦饭石为吸附载体，按载体∶菌剂（0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1）的质量体积比进行吸附，考察筛选最适吸附比，由图1可知，随着载体菌剂比例增大，最终获得的固体菌剂有效活菌数逐渐降低，4种比例获得的固体菌剂有效活菌数依次是11.9、11.3、10.9、7.8 （108 CFU·g-1）。由方差分析结果可看出，当载体菌剂比例大于1∶1的时候，制得的固体菌剂有效活菌数出现显著性差异，相较之前下降明显，考虑到节约载体成本及菌剂干燥能耗等，最终确定载体与液体菌剂的吸附比例为1∶1。

2.3 菌剂最适干燥温度

从图2可以看出，按麦饭石与纳豆芽胞杆菌发酵液1∶1吸附后，采用40、50、60、70℃恒温干燥方式干燥后有效活菌数分别为10.9、10.4、9.68、7.4、6.2（108 CFU·g-1）；通过显著性分析，可看出随着干燥温度提高，有效活菌数逐渐降低，当温度高于60℃时，有效活菌数出现显著性降低，可能是过高的干燥温度易导致微生物死亡。因此，麦饭石与纳豆芽孢杆菌菌液以1∶1吸附后，采用40℃恒温干燥方式最佳。

2.4 菌剂保藏期及保藏条件

由图3可以看出，无机载体（麦饭石、活性炭）制得的固化菌剂，有效活菌数随时保藏时间增加而逐渐降低，当保藏时间达到6个月时，固化菌剂活菌数分别为2.8×108 CFU·g-1、1.9×108 CFU·g-1，活菌数残留率为初始活菌数的20.2%、18.6%。有机载体（麸皮、玉米粉、豆粕）制得的固化菌剂，有效活菌数随着保藏时间增加呈先增加后逐渐降低的趋势，在保藏时间1个月时，3种固化菌剂有效活菌数分别为9.2、8.9、8.6（108 CFU·g-1），比初始活菌数提高了13.6%、9.9%、8.9%；保藏2个月时仍高于初始活菌数，6个月后，3种固化菌剂有效活菌数分别为2.3、2.1、1.9（108 CFU·g-1），活菌数残留率为初始活菌数的28.4%、25.9%、24.1%。由于有机载体（麸皮、玉米粉、豆粕）可为微生物提供一定的营养，使其保藏初期固体菌剂有效活菌数有一定幅度的提升，同时在整个保藏期内维持着一定的养分水平，使其活菌数残留率高于无机载体（麦饭石、活性炭）。

图4表明，低温4℃进行固体菌剂保藏，整个保藏期内活菌数变化与25℃保藏基本一致，保藏6个月后，麦饭石固化菌剂有效活菌数为2.9×108 CFU·g-1，相较25℃保藏下的活菌数有一定提升，但考虑到成本、便利性等，最后确认25℃为最适保藏温度。

3 讨论与结论

本研究对一株纳豆芽胞杆菌的固体菌剂制备工艺进行了初步研究，确定了最适吸附载体为麦饭石，麦饭石与发酵液按1∶1（g·mL-1）比例混匀，在温度37℃，转速150 r·min-1摇床上进行吸附60 min，再于最适干燥温度40℃下恒温干燥至衡重，即得固体菌剂，其有效活菌数高达1.09×109 CFU·g-1。

麦饭石作为吸附剂的研究与应用一直受到广泛的关注；王岩等[11]研究发现，麦饭石对灭线磷、久效磷等农药残留都有显著得吸附作用。常新强等[12]研究麦饭石对重金属的去除率，发现改性的麦饭石，因增加了大量的微空隙，使其比表面积增大，从而大大提高了重金属的去除率。然而目前还未有见有关麦饭石吸附微生物菌剂的报道。本研究通过比较不同载体材料吸附菌剂的效果，发现麦饭石吸附效果优于活性炭、麸皮、豆粕、玉米粉，并且25℃下保藏6个月后，有效活菌数仍高达2.9×108 CFU·g-1，残留率为20.2%，为麦饭石在菌剂吸附方面的应用提供了参考。

同时，马荣梅等[13]研究发现，对于液体XM菌剂，混合载体比单一载体的吸菌效果更好，更适合微生物的生长繁殖，而本研究中亦发现麸皮、豆粕、玉米粉制得的固体菌剂，因含有一定量的营养物质，在保藏初期（2个月内）活菌数表现出小幅度增长，且经过6个月保藏后，有效活菌数残留率28.4%，高于无机载体，进一步说明一定的营养成分有利于固体菌剂的生长与长期保藏。因此在本研究的基础上，考虑进一步对混合载体（麦饭石，硅藻土、麸皮、玉米粉等）进行组合优化，进一步提高固体微生物菌剂活性及保藏效果。另外，有研究表明，对吸附载体进行一定程度的改性[14]，有利于提高其吸菌效果，亦是改良微生物固体菌剂的重要手段。

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（责任编辑：林海清）