广西火桐基因组DNA提取方法的研究

摘要：以广西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]叶片为试料，比较了改良CTAB法、试剂盒法和改良SDS法提取基因组DNA的提取效果及对干燥叶和鲜叶提取的基因组DNA进行了比较研究。结果表明，改良CTAB 法和试剂盒法提取的基因组DNA质量较好、杂质少，适合广西火桐基因组DNA的提取。改良SDS法提取的基因组DNA无完整条带，质量较差，不适合广西火桐基因组DNA提取。硅胶干燥90 d的叶样和新鲜叶样所得的基因组DNA纯度相当，产率前者多于后者。

关键词：广西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]；基因组DNA；提取

中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5060-03

Studies on Genomic DNA Extraction of Erythropsis kwangsiensis

LUO Wen-hua1，HUANG Shi-xun1，MA Hu-sheng1，FU Zhi-hong1，2，DAI Wen-juan1，

TANG Wen-xiu1，PAN Bo1，ZHAO Bo1

（1.Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chineses Academy of Sciences， Guilin 541006，Guangxi， China； 2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004，Guangxi， China）

Abstract： Using the leaves of Erythropsis kwangsiensis as material， the genomic total DNA was extracted. Three methods of genomic total DNA extraction including improved CTAB method， reagent box method and improved SDS method were compared. Results showed that the DNA extracted from improved CTAB method and reagent box method had high quality and less impurity， but quantity of the latter was less than that of the former. The reagent box method had the advantages of simple operation， short time and less harmful， but more expensive than that of the improved CTAB method. In addition， improved SDS method didn’t have the complete bands， so it was not suitable for genomic DNA extraction of Erythropsis kwangsiensis. The genomic DNA extracted from the leaves preserved in silica gel for 90 days were not significantly different from that of fresh leaves， and the yield of the former was much more than that of the latter.

Key words： Erythropsis kwangsiensis； genomic DNA； extraction

广西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]隶属梧桐科火桐属（Erythropsis）植物，为中国特有种，仅分布于广西壮族自治区中部至南部的石灰岩地区，对研究植物区系和植物地理及亲缘关系等均有重要的学术价值。其木材纹理直，材质柔韧，不开裂，是制作家具的上等用材；其先花后叶，花色鲜艳靓丽，花期长，具有极高的经济和观赏价值。由于人类的过度利用，广西火桐野外种群和个体数量稀少，已处于濒危状态，为国家二级重点保护植物[1]。目前，对广西火桐的研究仅限于光合速率、群落及种群生态学特征等方面[2-6]，其基因组DNA提取方法的研究还未见报道。本试验研究了不同提取方法提取广西火桐基因组DNA的提取效果，为广西火桐的群体遗传多样性研究奠定基础，探讨硅胶干燥叶样与鲜叶DNA的区别，为野外样品保存提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

广西火桐采自广西壮族自治区靖西县，选取无病虫害的当年生嫩叶，用变色硅胶室温保存90 d，嫩叶完全干燥；广西火桐新鲜嫩叶采自广西植物研究所。

1.2 方法

1.2.1 不同提取方法提取基因组DNA 分别采用改良CTAB法[7]，植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）法和改良SDS法[7]提取总DNA。

1）改良CTAB法提取基因组DNA。①取0.1 g硅胶干燥叶片，加入适量石英砂，使用多样品组织研磨机（美国BIOSPEC/Mini-BeadBeater-96）研磨成细粉。②加入2 μL β-巯基乙醇和800 μL预热的2×CTAB抽提液。③充分混匀后于65 ℃水浴60 min，颠倒两次混匀。④12 000 r/min离心10 min，抽提上清液至新EP管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）充分混匀，12 000 r/min离心5 min，抽提上清液至新EP管中。⑤重复④一次。⑥上清液加1/10体积3 mol/L NaAC（pH 5.2），再加入等体积异丙醇，上下颠倒3～5次，至白色絮状物出现，置-20 ℃冰箱沉淀过夜。⑦4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清。⑧沉淀物分别用70%无水乙醇洗涤两次。⑨室温下自然晾干，溶于20 μL的ddH2O中，保存于-20 ℃冰箱。

2）植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司），操作步骤参照说明书。

3）改良SDS法提取基因组DNA。将CTAB提取液换为SDS提取液[100 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，2%（W/V）SDS，pH 8.0]，其他操作步骤同CTAB法。

1.2.2 试剂盒法提取干燥叶和新鲜叶基因组DNA 分别称取0.1 g硅胶干燥叶和1.0 g新鲜叶，操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.3 基因组DNA检测

1）取2 μL基因组DNA样品以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，使用生物电泳图像分析系统（美国UVP）成像，观察基因组DNA的大小、完整性及电泳条带的清晰度。

2）用TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）检测260 nm和280 nm下的吸光度。DNA纯度决定于A260 nm/A280 nm的大小；DNA质量浓度由DNA模板在260 nm的吸光度决定，A260 nm=1时，DNA质量浓度为50 ng/μL[8]，DNA产率的大小按照下式计算：

DNA产率（μg/g）=

■

2 结果与分析

2.1 不同方法提取基因组DNA

从图1中可知，改良CTAB法（C1、C2、C3）和试剂盒法（J1、J2、J3）提取得到的DNA有明显的主带，DNA完整，较明亮，质量较高，无明显的拖带，两种方法提取的DNA质量相当；改良SDS法（S1、S2、S3）无完整的DNA主带，但有弥散的条带，根据大小判断DNA片段已降解为小分子。改良CTAB法和试剂盒法提取的基因组DNA最佳，适合提取广西火桐基因组DNA；改良SDS法不适合广西火桐基因组DNA的提取。3种方法提取得到的DNA的点样孔亮度较低，说明残留物少，杂质去除较彻底，提取得到的基因组DNA较纯。

2.2 干燥叶和新鲜叶提取基因组DNA的比较

由图2可知，鲜叶（X1，X2，X3）和干燥叶（G1，G2，G3）基因组DNA主带明显，谱带清晰，完整性好。试剂盒法提取的硅胶干燥90 d的叶片基因组DNA和鲜叶的无明显差异。有研究表明半年内不同保存时期的材料对于基因组DNA提取几乎没有影响[9]，从变色硅胶干燥的叶片中提取的基因组DNA质量与鲜叶无明显差异， 且产率更高[10，11]。这可能是因为通过干燥，细胞内含水量较少，部分酶活性降低，在提取过程中对DNA分离造成的干扰较小，更有利于DNA分离。因此，用变色硅胶快速干燥法保存材料是可行的。

2.3 产率及纯度检测

3 种方法提取的基因组DNA的纯度及产率见表1。当A260 nm/A280 nm约为1.8时，DNA较纯；A260 nm/A280 nm大于1.8时，DNA中有RNA污染，A260 nm/A280 nm小于1.8时，DNA中有蛋白质污染[12]。改良CTAB 法提取的基因组DNA的A260 nm/A280 nm在1.89～1.95 之间；试剂盒法提取的干燥叶基因组DNA的A260 nm/A280 nm在1.81～1.83之间，鲜叶的A260 nm/A280 nm在1.81～1.86之间；改良SDS法提取的基因组DNA的A260 nm/A280 nm 在1.12～1.32 之间。结果表明，改良CTAB法和试剂盒法提取的基因组DNA较纯，鲜叶和硅胶干燥叶片基因组DNA的纯度相当，改良SDS法提取的基因组DNA中存在蛋白质或酚杂质。从产率上看，改良CTAB法为185～214 μg/g；试剂盒法提取干燥叶的基因组DNA为180～196 μg/g，略少于改良CTAB法；试剂盒法提取鲜叶的基因组DNA为156～172 μg/g，略少于干燥叶的基因组DNA；改良SDS法由于蛋白质、酚类等杂质污染无法精确计算产率。综合上述结果表明，改良CTAB方法和试剂盒法提取的基因组DNA质量明显优于改良SDS法，试剂盒法提取得到的鲜叶基因组DNA产率<干燥叶<改良CTAB法。

3 小结与讨论

植物基因组DNA提取常用的是CTAB法，其具有稳定性好、得率高、费用低等优点，但其操作步骤繁琐，所用药品中的异丙醇、巯基乙醇等对人体毒性很大，且不同植物有不同的特性，采用传统的CTAB法往往难以获得满意的结果。因此，研究者们针对不同的植物，创建了各种具有针对性的改良方法，使得改良后的CTAB法能够提取到高质量的基因组DNA[13，14]。植物基因组DNA提取试剂盒以CTAB法为基础，采用独特的相分离技术，结合DNA制备膜技术，有效地去除蛋白质、多糖及脂质等杂质，得到高纯度的基因组DNA，其特点步骤简洁、快速，提取到的DNA纯度较高[15，16]。SDS法也被广泛用于植物基因组DNA的提取，但该方法对于多糖含量高的植物提取效果不佳[17]。通过改良提取缓冲液的配方，能有效地回收材料中的基因组DNA，得到较为完整的基因组DNA[18]。

本研究中改良CTAB法和试剂盒法提取得到的基因组DNA有明显的主带，较完整，谱带较亮，较为适合广西火桐基因组DNA的提取。试剂盒提取基因组DNA耗时短，毒性小，纯度更高，优于改良CTAB法。但从产率上看，试剂盒提取基因组DNA略低于改良CTAB法。改良SDS法提取的基因组DNA条带不完整，杂质较多。可见，SDS法只能针对某种特定材料作出改良，不具有对多种植物的普遍适用性。

参考文献：

[1] 傅立国.国家重点保护野生植物名录（第一批）[J].植物杂志，1999（5）：4-11.

[2] 毛世忠，唐文秀，骆文华，等.濒危植物广西火桐净光合速率及其影响因子研究[J].广西农业科学，2010，41（11）：1165-1168.

[3] 骆文华，毛世忠，丁 莉，等.濒危植物广西火桐群落特征研究[J].福建林业科技，2010，37（4）：6-10.

[4] 骆文华，毛世忠，丁 莉，等.濒危植物广西火桐种子繁殖技术及幼苗生长节律[J].福建林学院学报，2011，31（1）：48-51.

[5] 付传明，黄宁珍，骆文华，等.广西火桐的组织培养和植株再生[J].植物生理学通讯，2010，46（12）：1253-1254.

[6] 毛世忠，唐文秀，骆文华，等.不同栽培基质对广西火桐幼苗生长及净光合速率的影响[J].西北林学院学报，2011，26（5）：96-99.

[7] 邹喻萍，葛 颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京：科学出版社，2001.16-17.

[8] CHAPELA M J， SOTELO C G，PEREZ-MARTIN R I， et al.Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification[J]. Food Control，2007，18（10）： 1211-1215.

[9] 李学营，彭建营，彭士琪.部分枣属植物硅胶干燥叶DNA提取方法的比较[J].河北农业大学学报，2006，29（1）：38-40.

[10] 曾 群，米丽华，宋 强.连翘干叶片和鲜叶片DNA提取方法和质量比较研究[J].光明中医，2011，26（7）：1347-1349.

[11] 王 婷，周凤琴，李 佳，等.忍冬干叶基因组DNA提取方法的研究[J].中华中医药学刊，2008，26（3）：496-498.

[12] SHARMA A D， GILL P K，SINGH P.DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J]. Plant Mol Biol Rep，2002，20（4）：415.

[13] 李志真，谢一青，黄儒珠，等.不同保存方法对光皮桦总DNA提取效果的影响[J].分子植物育种，2006，4（1）：131-134.

[14] 张国防，陈存及，邢建宏.樟树干叶DNA 提取方法的研究[J].江西农业大学学报，2006，28（1）：111-114.

[15] 梁玉琴，李芳东，傅建敏，等.柿属植物基因组DNA提取方法比较[J].中南林业科技大学学报，2012，32（4）：170-173.

[16] 刘 杰，高连明.红豆杉属植物三种不同总DNA提取方法的分析比较[J].广西植物，2011，31（2）：244-249.

[17] 邹喻萍，汪小全，雷一丁，等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[J].植物学报，1994，36（7）：529-532.

[18] 单 志，吴宏亮，李成磊，等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J].广东农业科学，2011，38（8）：113-115.