内生菌在修复重金属污染土壤的研究进展

文章编号：1007-0370（2013）12-0068-04

我国土壤污染日益严重，其中重金属污染因其具有难降解性、强毒性、生物积累和生物放大效应等，已成为亟待解决的问题[1]。近几十年来，国内外已研发出诸如生物、物理、化学及其联合等重金属污染土壤修复技术[2]。其中，生物修复技术因具有成本低、效率高、无二次污染和适用范围广等优点，是替代物理、化学修复的一种具有显著优势的技术[3]。它主要包括植物修复、微生物修复及植物/微生物联合修复技术。由于微生物不能降解和破坏重金属，且微生物个体太小，吸附的重金属难以从土壤中去除等缺点，单纯的微生物修复不是修复的根本途径[4，5]。植物修复虽克服了微生物修复难以收集的缺点，但过量的重金属往往对植物生长产生抑制，导致修复过程缓慢。利用植物/微生物联合技术是生物修复的有效措施[6]。目前该类研究主要集中于根际微生物与其宿主植物方面，但根际微生物往往会对多变的土壤环境产生不适应或者受到土壤本土微生物竞争及原生动物的吞噬等作用，造成修复效果不稳定[7]。植物内生菌（Endophyte）是寄居在植物体内，但并不使植物表现出特定症状的一类微生物，它们生活在植物组织内部，长期以来与宿主植物形成了紧密的共生关系，在植物病害防治与生物修复中均具有独特的优点。利用内生菌进行植物/微生物联合修复重金属污染土壤，不仅可克服单独微生物修复中微生物难存活与难收集的缺点，而且还可以改善植物修复效果，具有广阔的应用前景。

1植物内生菌概述

1.1植物内生菌种类

植物内生菌（Endophyte）是指那些在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各组织和器官内部的真菌或细菌。它们既可以产生各种化学物质，又可以通过竞争或其他作用来抑制寄杀死各种致病菌，是对植物组织没有引起明显病害症状的微生物[8]。

植物内生菌包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。几乎所有植物中都存在内生菌，在一种植物上可分离到数种至数十种内生菌，其种类极其丰富。根据其生存策略，内生菌可分为专性和兼性内生菌。其中专性内生菌严格依赖其宿主植物生存，需要通过载体转移到其他植物体内，而兼性内生菌因其生活史的某部分在宿主植物体外，故对宿主植物的依赖性不强。

大多数植物内生真菌属于子囊菌类（Ascomycetes），包括核菌纲（Pyrenomyetes）、盘菌纲（Discomyetes）和腔菌纲（Loculoascomyetes）的许多种类以及它们的一些衍生菌，现已在80多个属的几百种禾本科植物中发现有与之共生的内生真菌[5]。目前已分离得到的内生细菌已超过129种，分别属于54个属，且多为土壤微生物种类。内生放线菌主要是丝状放线菌、链霉菌属。

1.2具有重金属抗性的内生菌

通常，富集大量重金属的超富集植物将为其内生菌提供一特殊的环境以适应高浓度的重金属。目前已从Alyssum bertolonii，Thlaspi caerulescens，Thlaspi goesingense ，Nicotiana tabacum，Solanum nigrum等超富集植物体内分离出具有重金属抗逆性的内生菌[9-12]。

传统的纯培养方式是从植株中分离内生菌的主要方法。Lodewyckx等[10]采用纯培养方法分离出了具抗Zn和Cd超富集能力的内生菌T. caerulescens sub sp.Calanibaria.，结果表明，不同植物器官具有不同的内生菌群体结构。Guo等[11]从具有超级富集镉的龙葵植株中分离出一株Bacillus sp.L14菌株，结果表明，该菌株对二价重金属Cu （II）， Cd （II） 及Pb （II）具有较强的抗性能力。Kuffner等[12]采用不同的培养基分离出具有抗Zn/Cd的根际微生物及内生菌，结果表明这些微生物大多属于Proteobacteria，Actinobacteria 及Bacteroidetes /Chlorobi属。

目前，基于分子生物学技术如DGGE、ARDRA及T-RFLP等已应用于内生菌种群动态研究。Idris等[13]通过克隆ncc基因序列，采用T-RFLP技术分析了含高浓度Ni土壤中超富集植物T. goesingense内生菌的16S rDNA，并通过可逆性实验得出T. goesingense芽中的内生菌具有比根际微生物高的抗Ni性能。研究表明，M. extorquens，M. mesophilicum 及 M. goesingense菌属具有很高的抗Ni性能，各菌属具有不同的抗性性状及独立的进化路径。大部分从抗Zn超富集植物T. caerulescens中分离的内生菌均属于Methylobacterium及Sphingomonas属，并具有强抗Ni的能力。Barzanti等[14]从A. bertolonii植物的芽、茎及叶中分离到83株内生菌，采用ARDRA方法对其16S rDNA进行分析，得出23个不同的聚类。大部分的菌属具有多种重金属的抗性能力，其中，对Ni、Cr、Zn和Cu的抗性能力强于对Ni和Co的能力。

2内生菌在重金属污染土壤修复中的研究

2.1内生菌抗重金属机理

内生菌对其宿主植物具有营养及非营养的益处，对自然及人工生态系统具有重要价值，可作为生物肥料，增加宿主植物的生产力。同时，由于大部分内生菌为兼性内生，能像根际细菌样生存于植物体外，且目前分离到的内生菌多为常规土壤细菌，因此内生菌在促进植物生长，抵抗重金属压力等方面与根际细菌具有相似的机理，包括如固氮、矿物溶解、光合作用、载运铁、利用1-氨基环丙烷-1羧酸为唯一N源、传递营养物质等[11-15]。研究发现内生菌还能通过为其提供矿物营养物，增强抵抗外界生物或非生物压力的形式来促进宿主植物健康生长，这些机理在重金属污染的土壤中也存在。而且，内生菌采用对宿主植物的渗透压调整、气孔调控、根际形态的修饰、增强矿物的吸收、氮素的吸收及代谢等方式促进植物的生长[16]。目前已成功在植物内接种具有对重金属抗逆性的内生菌，显示了内生菌在植物修复中的巨大潜力，如表1所示[17-18]。

重金属污染土壤中，内生菌产生的植物激素在植物与微生物，植物的生长方面扮演着重要的角色。大量的研究证明了内生菌能产生植物激素，如假单胞菌（Pseudomonas），肠杆菌（Enterobacter），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus），固氮菌（Azotobacter）和固氮螺菌（Azospirillum）产生生长激素及细胞分裂素等，这些激素与赤霉素一起可能构成植物生长发育的诱导剂。接种了固氮螺菌的根尖具有较强的细胞膜活力，较高的吲哚乙酸、吲哚-3丁酸浓度，增强了三羧酸循环及糖酵解能力[19]。不同微生物物种具有不同的吲哚乙酸浓度，不同浓度的吲哚乙酸促进植物根系得到不同的生长长度。内生菌产生的低浓度植物激素促进主根系的初级成长，高浓度激素促进侧根及不定根的生长但抑制主根的生长。内生菌能够通过调节植物内分泌平衡来促进植物生长。接种荧光假单胞菌（P. fluorescens）的植物对Pb具有抗性，其原因在于荧光假单胞菌产生并排泄吲哚乙酸到植物体内。内生菌产生植物激素并影响到其宿主植物的生长发育。

利用1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）为唯一氮源是内生菌影响其宿主植物生长的另一种方式。ACC酶是植物乙烯合成的重要酶，而乙烯是植物生长发育如种子发芽、子叶生长及叶片脱落等生理过程的重要生物激素，因此，ACC脱氨酶是内生菌操控其宿主植物的重要手段。ACC脱氨酶主要存在于植物根系的质外体内，分解成能被细菌代谢的氨及 -酮丁酸。内生菌通过降低宿主内乙烯浓度及抑制乙烯合成来促进根系的生长。Idris等[13]研究发现，以ACC为唯一氮源的内生菌的比例（36%）较根际微生物的比例（20%）高。Lodewyckx等[10]从水稻组织中分离出的methylotrophic菌属如Methylobacterium oryzae 和 Burkholderia sp.能够保护西红柿种子使其能够在高Ni和Cd的环境中生长发芽。产生这种现象的原因在于Ni和Cd诱导内生菌降低了植物内的乙烯浓度，同时接种的内生菌富集并积累了一定量的重金属，减轻了重金属对植物的毒性。

2.2内生菌的分离、筛选及检测

由于内生菌在植物的根、茎、叶、花、果实等器官的组织中均广泛存在。通常选取长势好、无病害的植株，采用直接切取植物组织分离的方法或榨取植物组织汁液稀释分离的方法从植物体中分离内生菌。常用平板划线和稀释涂布的方法纯化所分离出的内生菌，纯化后接种于试管斜面培养基上，在5℃温度下保存，供作进一步的筛选。

筛选重金属抗性内生菌，常采用培养基平板对峙培养法和抑菌圈法，即通过观察内生菌生长被抑制的程度来判断其对重金属拮抗作用的大小。但内生菌在离体条件下对重金属的抑制能力与在活体上对该重金属的抗性能力并不一定呈正相关，因此，必须进行内生菌在活体上对重金属的抗性检验。

检测植物体内内生菌的方法有不少，最早采用苯胺蓝染色光学显微镜观察法来检测内生真菌，此法简便易行，结果直接明了，现在仍然在采用。20世纪80年代以来，一些先进的技术手段也应用于内生菌的检测，其中酶联免疫分析（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA） [20]和近红外反射光谱分析（Near Infrared Spectroscopy， NIRS）方法被用于内生真菌的定量检测。

目前检测植物体内内生细菌采用较多的是抗利福平标记法，此方法比较简便，但用此方法对内生菌的定量测定不准确且易出现抗抗生素屏蔽现象。现在大量微生物的基因序列被测定并输入国际基因数据库（GEN BANK），通过对未知微生物16S rDNA 序列进行测定和比较分析可以快速有效地鉴定分类。所以，用分子生物学的方法来检测内生菌，既可以定性又可以定量，但是所用成本较高，花费时间较长。

3展望

植物内生菌生境的特殊性决定了内生菌既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源。从目前生物修复的发展趋势分析，协同利用植物与微生物修复环境污染无疑具有很大的潜力。在进行重金属污染土壤的生物修复过程中，重视并应用植物内生菌转移、积累重金属的特性，实现内生菌与超富集植物协同治理具有重要的实践价值。

参考文献

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作者简介： 王银科，男，汉族，1998年4月出生，长沙南雅中学在读学生.