里氏木霉发酵培养基的响应面法优化

V���m��jw^�('��)�{���iǚ��r�+&z�hv�h�/�:�rz����z!�+y��r�❣(�)bjW�=��r)e�隆��"http://www.yzmjgc.com/p/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。研究高产里氏木霉的液体发酵条件尤为重要。

本试验利用响应面法对里氏木霉发酵的关键因素进行了优化。从Plackett-Burman试验可以得知，鱼蛋白胨和葡萄糖对里氏木霉的菌丝产量影响显著，所以利用响应面试验设计以这两个因素为自变量，以里氏木霉菌丝量为响应值，通过Minitab 15软件对试验数据进行多项式回归分析，建立多元二次回归方程，利用方差分析模型和各因子的显著性获得里氏木霉液体发酵工艺的最佳参数，以期为里氏木霉制剂的开发提供参考[1-6]。

1  材料与方法

1.1  材料

1）菌株。里氏木霉是湖北省生物农药工程研究中心生物技术研究室分离保存，能够拮抗多种植物病害，保存于-80 ℃超低温冰箱。

2）培养基。固体培养基为PDA培养基，2%琼脂;种子培养基为PDA培养基;发酵培养基为葡萄糖0.5 g/100 mL、豆粕0.2 g/100 mL、鱼蛋白胨1.0 g/100 mL、甘油0.5 g/100 mL、玉米浆1.0 g/100 mL;后期采用优化后的配方。

1.2  方法

1）发酵培养条件。接种体积分数5%，发酵温度30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵96 h。

2）Plackett-Burman试验。采用Minitab的Plackett-Burman两水平法对培养基成分进行考察，筛选影响棘孢木霉生物量的重要因素，确定最佳配方。设计水平和排列方式见表1。

3）最陡爬坡试验。根据Plackett-Burman试验得出的拟合方程安排最陡爬坡试验来确定因素取值中心点。拟合方程中各变量系数确定爬坡方向和变化步长，另外步长确定亦与试验条件相关。

4）中心组合设计和响应面分析。对Plackett-Burman试验确定的因素，以最陡爬坡试验得到中心点，根据中心组合设计原理安排响应面试验获得重要因素的最佳配方水平。根据中心组合设计结果来拟合数据，得到描述响应值和自变量之间关系的二阶模型，即：

其中，Y是产物能力测量值，b0是截距，bi是关键因素线性效果的系数，bii是关键因素的二次效应的系数，bij是关键因素间交互作用的系数。

根据拟合的数学模型以及方差分析的結果评价每个因子及其交互作用对过程的影响程度，利用响应面图和等高线图直观地描绘其结果，同时利用拟合的数学方程求解最优结果。

5）培养基优化结果验证试验。用优化后的培养基组分配制发酵培养基，发酵结束后测定发酵液中的菌丝重量。

2  结果与分析

2.1  Plackett-Burman试验结果

根据前期研究结果，确定以葡萄糖和甘油为碳源，以鱼蛋白胨、玉米浆和豆粕为氮源，共5种因素（X1：葡萄糖;X2：豆粕;X3：鱼蛋白胨;X4：甘油;X5：玉米浆）一起进行Plackett-Burman设计试验，设计方案和试验结果见表1。

由T检验结果可知，鱼蛋白胨和甘油对里氏木霉的菌丝生长具有显著影响，可信度在95%以上。且两者对里氏木霉的菌丝生长影响是负效应。

由上述Plackett-Burman试验得到的回归方程如下：

Y=49+0.042X1+2.11X2+5.6X3+5.8X4+0.46X5，方程拟合的相关性为R2=0.953 4，表明此多项式方程很好地模拟和解释了Plackett-Burman的试验结果。

2.2  最陡爬坡试验结果

找到对产物发酵影响最大的因素后，需要进一步对这些因素进行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman设计试验得到的一次方程为基础，以相应因素的系数比为基准进行步移，直到步移至最高点，然后以最高点附近的范围作为响应面优化的相应范围。从Plackett-Burman设计试验得到方程中鱼蛋白胨和甘油的系数（X1∶5.6;X2∶5.8），可以得到这两个因素步移的步长比为1∶1，即当鱼蛋白胨步移1个单位（0.2 g/L）时，甘油也步移1个单位（0.2 g/L）。以Plackett-Burman设计中的中心点作为步移的起点，试验设计与试验结果如表2所示。从试验结果可以看出，里氏木霉菌丝体的产量在步移进行至第三步时达到最高点，之后里氏木霉菌丝体产量开始下降。步移最高点时鱼蛋白胨和甘油的浓度分别为1.00和1.26 g/L，这一点被用作下一步响应面分析的中心点。

2.3  中心组合设计试验结果

根据以上两水平Plackett-Burman试验可知，影响里氏木霉生物量的两个重要因素分别是鱼蛋白胨和甘油。根据中心优化组合方法，试验设计及结果见表3，共13组试验。

以鱼蛋白胨和甘油为自变量，以里氏木霉的菌丝体湿重为响应值，根据分析结果得到的二次多项式回归方程为Y=84.98+0.583 4X1+3.555 5X2-5.971 2X12-9.071 3X22+1.975X1X2，Y为响应值，X1为鱼蛋白胨，X2为甘油。利用Minitab软件响应优化器进行计算可得，最大值处X1=1.414 3 g/100 mL，X2=2.439 3 g/100 mL，在此条件下理论预测得到的值为85 g/100 mL。

2.4  最佳培养基的验证

为了确定试验结果的可靠性，对上述优化条件进行了验证试验，共进行3组平行试验，结果表明，里氏木霉的菌丝体产量为81 g/100 mL，与预测值十分接近。

3  小结

对里氏木霉生长培养基进行了优化研究，得到最佳培养基配方为葡萄糖2 g/100 mL、豆粕1 g/100 mL、鱼蛋白胨1.414 3、甘油2.439 3、玉米浆1 g/100 mL。在此条件下，里氏木霉的菌丝体理论最高产量为85 g/mL，验证试验中最高值为81 g/100 mL，与理论预测值相符，约是优化前实际产量（60 g/100 mL）的1.35倍。

参考文献：

[1] 张保元，许梦秋，谢响明.粉红粘帚霉67-1液体发酵生产生物农药概述[J].现代农业科学，2009，16（3）：20，31.

[2] 邹  勇，文成敬，唐贵群，等.几个因素对木霉菌株T-33产生厚垣孢子的影响[J].微生物学通报，2006，33（4）：43-47.

[3] 宋文婧，刘振邦，朱  虹，等.十种虫生真菌液体培养芽生孢子的形态发生[J].菌物学报，2011，30（4）：572-579.

[4] 高克祥，项存悌，骆会欣，等.木霉菌株T-（88）生物学特性的研究[J].东北林业大学学报，1995，23（2）：33-39.

[5] 陈建爱，肖  敏，王未名，等.木霉诱变菌株发酵条件研究[J].核农学报，2002，16（5）：305-309.

[6] 庄敬华，高增贵，刘  限，等.不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J].中国生物防治，2005，21（1）：37-40.