黄芪、党参水提物对自制腊肠中5种腐败菌的抑菌活性的研究

总结其规律，找到上述中药材作为腊肠防腐剂的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自制无添加腊肠：购于张掖新乐超市;PCA平板计数琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、0.9%无菌生理盐水溶液：青岛高科园海博生物技术司。

1.2 仪器与设备

全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃;LMQ.C全自动电热压力蒸汽灭菌锅，山东新华医疗器械股份有限公司;BHC-1300ⅡA2生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司;SPX-250生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有效成分的提取

近几年发展的新型技术有超临界流体萃取法、超声波辅助提取法、微波法和生物酶解法。不同方法对黄芪、党参水提物的提取效果，已有多位学者[7-8]进行了研究。本实验选择超声波辅助提取法，以水为溶剂对上述两种植物进行提取。具体过程为：分别称取上述干燥药材粉末（过65目筛网）约150 g，加入10倍量的80%乙醇回流2 h，过滤，弃去滤液，滤渣以水作为提取溶剂，料液比1∶10（g/V），在超声温度50 ℃，超声波功率500 W、提取时间45 min的条件下提取，经过滤后，滤液加入乙醇至乙醇浓度为80%（V/V），静置沉淀48 h，滤过，滤渣即为粗水提物产物。

1.3.2 腊肠的加速腐败及腐败菌的分离

将自制腊肠剥去肠衣后在环境中放置72 h，相对湿度50%，35 ℃下进行加速腐败培养，5 d后切取腐败后的香肠10 g加入100 mL含0.9%无菌生理盐水溶液的均质袋中制成样品菌悬液，充分拍打混匀，稀释至10-6

～10-7CFU/mL后，分别取0.1 mL样品液于PCA平板计数琼脂培养基和孟加拉红琼脂培养基上，涂布均匀后将细菌放置在37 ℃下培养18～24 h，霉菌放置在28 ℃下培养3～5天。用接种环挑取菌落数在30～300的平皿上的典型菌落，然后进行四区划线培养，反复划线纯化所得的菌落，最終得到纯化的单菌落。将经过纯化处理的菌种进行试管斜面划线保存。

1.3.3 腐败菌种的鉴定

采用形态学检定与全自动微生物分析仪进行微生物菌种鉴定。形态学观察：观察平板上单菌落的形态特性，利用文献中的菌落形态学特征，记录平板上单菌落的菌落形态特性，对腐败菌种进行初步判断。生理生化鉴定：利用全自动微生物鉴别系统，对被测菌进行多组生化试验，根据实验结果，参考《常见与常用真菌》[9]《细菌系统鉴定手册》[10]《伯杰氏细菌手册》[11]中对细菌的生化特征鉴定的有关描述，对待腐败菌进行分类鉴定。

1.3.4 抑菌试验

1.3.4.1 菌悬液制备

用接种环沾取少量保存在斜面培养基上的菌种放入含10 mL胰酪大豆胨液体培养基试管中，细菌于37 ℃培养18～24 h，霉菌于28 ℃培养3～5天。然后用无菌生理盐水稀释，稀释梯度为10-1、10-2、10-3、10-4与10-5，充分混匀，吸取100 μL在平皿底部，倒入冷却至45 ℃左右的琼脂培养基15～20 mL左右，摇匀，放在培养箱中培养后，进行菌落计数，找出合适的梯度，使菌悬液的浓度达到106～107 CFU/mL，保存备用。

1.3.4.2 溶液的制备

将水提物样品用纯化水溶解并用薄膜过滤法除菌后，分别配成质量浓度为0.1、0.2、2.0、20.0 mg/mL与80.0 mg/mL的水提物溶液。

1.3.4.3 水提物的抑菌试验

取制备好的菌悬液用涂布法[12]检验抑菌效果。向平皿中倒入冷却至45 ℃左右的琼脂培养基15～20 mL，待凝固后，分别加入100 μL菌悬液和100 μL不同浓度的水提物溶液，用一次性L棒涂抹均匀。每个菌种设2个平行组，将涂布好的平板倒置于培养箱中培养（细菌于37 ℃培养24 h，真菌在28 ℃培养72 h）后，进行菌落

计数。

1.3.4.4 最低抑菌浓度（MIC）测定

将经过过滤除菌的浓度为0.01、0.03、0.06、0.08 mg/mL与0.10 mg/mL的水提物溶液，定量加入到装有10 mL TSB液体培养基的试管中，然后吸取40 μL菌液加入至同一试管中，混匀。同时做一个空白和一个只加样品的对照。将试管放在37 ℃的恒温培养箱内培养24 h，观察并记录菌落的生长状况。以试管中肉眼可见浊度明显低于样品组浊度的浓度为最低抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

经过涂布和划线培养配合革兰氏染色，初步筛选出2种细菌和3种真菌，分别命名为J-1、J-2、J-3、J-4和J-5，其形态学观察结果和生理生化鉴定结果见表1和图1，参考《常见与常用真菌》《细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌手册》中对细菌和霉菌的生理生化特征鉴定的有关描述。结合对5种菌的形态学观察、生理生化鉴定试验结果，判断出5种菌分别为阴沟肠杆菌，托尔豪特链球菌、酵母菌、黑根霉与米曲霉。因为霉菌主要是形态学观察加之孢子传播性强，无法完全分离纯化，所以霉菌在一张平皿上观察，结果如图1。对细菌进行革兰氏染色镜检，结果如图2。

2.2 水提物抑菌试验结果

通过测定不同浓度黄芪、党参2种植物粗水提物作用下，5种腐败菌菌落数的数目来判断黄芪、党参水提物对所筛选细菌的抑制效果，试验结果见表2。

从表2可以看出，上述两种植物水提物对筛选出的5种菌均能起到较好的抑制作用，抑制作用随浓度的增大先增加后减小并趋于平稳。总体而言，两种水提物对真菌的抑制效果强于细菌。

当黄芪水提物质量浓度为0.01 mg/mL时，对5种菌的抑制效作用最弱，当质量浓度为0.2 mg/mL时，抑菌作用最明显。当党参水提物质量浓度为0.01 mg/mL时，对5种菌的抑制效作用最弱，当质量浓度为2.01 mg/mL时，抑菌作用最明显，且对酵母菌的抑制作用明显强于其他菌。原因可能是[13-15]：浓度较低时，渗透压较低，对菌的细胞壁和细胞膜的通透性影响较小，随着浓度的增大，渗透压增大，引起细胞内容物外泄，对菌的生长起到抑制作用，而当浓度过大时，由于单位体积的溶剂对样品的溶解度达到饱和，使得水提物的溶解和扩散受到了限制，进而影响了抑菌性。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）测定结果

由表3可知，水提物的浓度增大到一定值时，培养物中菌落的生长情况明显弱于样品组，此即水提物对该菌的最低抑菌浓度。由下表可知，黄芪水提物对阴沟肠杆菌和托尔豪特链球菌的最低抑菌浓度为0.06 mg/mL，对酵母菌、黑根霉、米曲霉的最低抑菌浓度为0.03 mg/mL;党参水提物对阴沟肠杆菌和托尔豪特链球菌的最低抑菌浓度为0.08 mg/mL，对酵母菌、黑根霉、米曲霉的最低抑菌浓度为0.06 mg/mL。上述结果表明两种水提物对两种细菌的抑制能力较三种真菌稍差。

3 结论

通过对自制腊肠中5种腐败菌的形态学鉴定、生理生化鉴定，表明5种细菌分别为阴沟肠杆菌、托尔豪特链球菌、酵母菌、黑根霉与米曲霉。黄芪、党参水提物对所筛选出的5种腐败菌的抑菌试验结果表示：黄芪粗水提物在质量浓度0.03 mg/mL时，开始对5种腐败菌表现出抑菌效果;党参粗水提物在质量浓度0.06 mg/mL时，开始对5种腐败菌表现出抑菌效果。两种水提物对酵母菌、黑根霉、米曲霉菌的抑菌效果较阴沟肠杆菌、托尔豪特链球菌明显。我国的黄芪、党参资源非常丰富，可作为天然抑菌物质的来源，本研究为黄芪、党参水提物作为一种防腐剂以食品添加剂的形式添加到食品中提供了一定的理论依据。

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作者简介：杨海雁（1991—），女，甘肃张掖人，本科，助理工程师。研究方向：食品药品微生物检验检测及代谢物分析。

通讯作者：于喆源（1991—），男，甘肃张掖人，本科，工程师。研究方向：食品药品检验检测及品质评价。