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北虫草在鸡蛋内培养与制备研究

发布时间:2022-03-12 08:35:20 | 浏览次数:

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1.1  材料

北虫草菌种来源于河北省科学院微生物研究所食用菌研究室,360日龄无公害鸡蛋由商水县为农养殖专业合作社提供。

1.2  试剂与仪器

高锰酸钾、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、琼脂、蛋白胨、β-环状糊精[9]等均为分析纯,75%乙醇,液体石蜡。

LDZH-100KBS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),PV-30/70型超净工作台(荣事达有限公司),SPX-100B-Z型生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),SY-6000型小型喷雾干燥仪(上海世远生物设备工程公司)。

1.3  方法

1.3.1  固体及液体培养基配伍  前期经多次配伍试验,优化固体培养基[10,11]为土豆200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 2.5 g、MgSO4 1.5 g、琼脂20.0 g,补水至1 000 mL,pH为7.0。液体培养基为葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、蛋白胨10.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4 1.5 g,超纯水1 000 mL,pH为7.0。

1.3.2  菌种筛选、复壮与保存  将北虫草菌种在固体培养基斜面上划线,28 ℃培养箱内培养7 d,得到活化的北虫草菌种,重新选择、挑取菌落块接种在固体培养基上,28 ℃培养箱内继续培养7 d,然后挑取菌落块于液体培养基中,三角瓶装液量为300 mL/L,28 ℃、150 r/min培养7~10 d,得到活化的北虫草种子液[12]。

1.3.3  无公害鸡蛋选择  选择同一批360日龄蛋鸡,饲养管理条件相同,鸡蛋收集前15 d鸡群未饲喂药物,环境、饲料、饮水、防疫措施等均符合无公害鸡蛋标准,随机采集180枚鸡蛋。

1.3.4  消毒  鸡蛋表面用无菌纱布擦拭后放入0.1%的高锰酸钾清洗1 min,再用75%乙醇消毒后备用。

1.3.5  接种  鸡蛋打孔后,用1 mL无菌针在尿囊腔和卵黄囊腔内接种北虫草菌种低剂量(0.1 mL)、中剂量(0.3 mL)各2组,在卵黄囊腔内接种高剂量(0.5 mL)菌种1组,对照组鸡蛋不接种菌种,每组30枚鸡蛋。

1.3.6  培养  参考北虫草对生长环境的要求[13,14],鸡蛋尿囊腔或卵黄囊腔内接种前3 d在20 ℃、湿度60%的恒温培养箱光照环境下培养,后3 d在23 ℃、湿度70%恒温培养箱内暗环境下培养。

1.3.7  喷雾干燥  于鸡蛋气室处破壳剥离蛋壳,在培养6、12、18、24日龄时,各取样品50 mL,加入超纯水、粉碎均质后采用4层纱布过滤,根据前期试验优化的工艺标准:进风温度150 ℃、进样量300 mL/h、空氣流量600 L/h、干燥剂比例4%进行喷雾干燥[15-17]、称重,观察试验结果。

1.4  数据处理

试验数据采用SPSS 24.0进行单因素方差分析,各组间数据的平均值采用邓氏多重比较进行差异显著性检验,测定结果以“平均值±标准误”表示,P<0.05表示差异显著。

2  结果与分析

2.1  北虫草菌种接种剂量对蛋虫草粉质量的影响

低、中剂量组喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增20.75%、34.95%,差异显著(P<0.05);高剂量组喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加5.23%,差异不显著(P>0.05)。中剂量组比低剂量组增加11.76%,差异极显著(P<0.01)。高剂量组比对照组增加5.23%,差异不显著(P>0.05),比低剂量组减少14.74%,差异显著(P<0.05),比中剂量组减少28.24%,差异显著(P<0.05)(表1)。

2.2  鸡蛋接种部位对蛋虫草粉质量的影响

尿囊腔、卵黄囊腔喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加34.76%、15.70%,差异显著(P<0.05)。卵黄囊腔比尿囊腔喷雾干燥的蛋虫草粉质量减少16.47%,差异显著(P<0.05)(表2)。

2.3  接种培养时间对蛋虫草粉质量的影响

6日龄喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加8.03%,差异不显著(P>0.05)。12日龄喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加11.34%,差异显著(P<0.05),比6日龄增加3.07%,差异显著(P<0.05)。18日龄喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加23.21%,差异显著(P<0.05);比6日龄增加14.05%,差异显著(P<0.05);比12日龄增加10.66%,差异显著(P<0.05)。24日龄喷雾干燥的蛋虫草粉质量比对照组增加3.49%,差异不显著(P>0.05);比6日龄减少4.38%,差异显著(P<0.05);比12日龄减少7.59%,差异显著(P>0.05);比18日龄减少19.06%,差异显著(P<0.05)(表3)。

3  讨论

3.1  接种剂量对蛋虫草发酵培养的影响

王蓉等[18]研究人工培养北虫草的接种菌种量为2.5~5.0 mL,但在鸡蛋内接种北虫草菌种的研究目前还未见报道。本研究结果表明,在鸡蛋内接种低剂量北虫草菌种,蛋壳膜增厚,鸡蛋内菌丝体生长发育良好,蛋虫草粉质量比普通鸡蛋明显增加,成功培育出蛋虫草,鸡蛋内的氮源、碳源能满足北虫草菌种的生长发育,突破真菌微生物在液体、固体培养基的生长模式。尤其接种中剂量北虫草菌种时,菌丝和蛋壳膜形成一体,菌丝体比低剂量北虫草菌种生长发育更好,蛋虫草粉质量极显著增加,证明鸡蛋内的营养能满足一定剂量菌种的正常生长发育。但当接种剂量过大时,蛋壳膜表现不明显,菌丝体生长发育受阻,蛋虫草粉质量比低剂量、中剂量明显减少,说明鸡蛋内的营养物质数量有限,不能满足足量的菌种生长发育,以接种中剂量时(0.3 mL)生长发育良好(表4、图1、图2)。

3.2  接种部位对蛋虫草发酵培养的影响

接种部位对蛋虫草发酵培养的影响结果和方华舟等[19]研究一致,在北虫草菌种培养中加鸡蛋为外源氮源效果良好,试验和对照组鸡蛋相比较,无论接种在尿囊腔或者卵黄囊腔内,菌丝体在蛋壳膜上生长,蛋壳膜逐渐增厚,蛋壳内环境发生不同程度的改变,北虫草菌种均能生长发育,但以接种在尿囊腔内的菌丝体变化明显,喷雾干燥的蛋虫草粉质量增加显著(表4、图3和图4)。

3.3  培养日龄对蛋虫草发酵培养的影响

通过观察在鸡蛋内接种3日龄后,北虫草菌丝体开始生长发育,蛋壳膜和菌丝膜形成一體、蛋清营养物质吸收稀薄如水样、蛋黄颜色的改变以及喷雾干燥蛋虫草粉重量等综合比较,在试验前生长发育不明显,到12日龄生长发育明显,尤其12~18日龄时生长发育良好。但随着日龄的增加,鸡蛋内的营养物质被菌种消耗殆尽,24日龄和对照组、6日龄、12日龄之间差异不明显,应该是菌丝体逐渐出现自溶现象,与张杨等[20]研究关于北虫草接种时间对培养基的要求基本一致(表4、图5和图6)。

4  结论

北虫草天然资源数量很少,再加上大量采挖已日渐枯竭,传统人工培养基以大米、小麦、高粱、蚕蛹粉等为主,各营养成分有限,对培养条件要求苛刻、工艺复杂、周期长,而鸡蛋中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物,能满足北虫草菌的营养需求,使之开发成具备多种营养的单一培养基质,接种后培养条件简单、周期短、方法简便,同时我国产蛋量大、价廉易得,因此将北虫草菌接种在鸡蛋内培养适合工业化批量生产。

通过试验将北虫草菌种接种在无公害鸡蛋内,以在尿囊腔内接种0.3 mL培养18日龄时,菌丝体变化明显、蛋壳膜和菌丝膜形成一体、蛋清营养物质吸收稀薄如水样,喷雾干燥蛋虫草粉质量增加显著,为北虫草培养新模式提供技术依据和理论基础,为研制北虫草提供新的思路和方法,为新型免疫增强剂的开发提供更多来源。

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