去除U（VI）的微生物组合构建及培养条件的优化

材料，筛选能耐受U（VI）的优势微生物和微生物组合，并且进一步探究在培养条件下微生物及微生物組合对U（VI）的去除效率，通过正交试验考察微生物组合去除U（VI）的最适pH、温度、U（VI）初始浓度。

1 材料与方法

1.1 微生物菌株 XJ1（Bacillus subtilis），芽孢杆菌属，新疆盐碱地分离的优势菌株；考式玫瑰菌（Kocuria rosea），考克式菌属，若尔盖铀矿分离的优势菌株；耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans），奇球菌属，来源于中国微生物菌种保藏中心；

柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），柠檬酸杆菌属，来源于中国微生物菌种保藏中心。

1.2 微生物培养基

为了消除微生物培养基对U（VI）测量的影响，选择相对于其他微生物培养基含有机成分较少的胰蛋白胨酵母葡萄糖培养基（TGY）。其主要成分为胰蛋白胨5.0 g、酵母粉3.0 g、葡萄糖1.0 g，定容至1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.3 培养条件下微生物对U（VI）的抗性与去除能力研究

在100 ml作用体系中，U（VI）初始浓度分别为10、30、50 mg/L，置于120 r/min的恒温振荡培养箱中培养60 h。用分光光度计在600 nm处测量细胞悬浮液OD值。每隔12 h取样，8 000 r/min振荡5 min，利用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法在652 nm处测量上清液中U（VI）浓度。重复3次。微生物对U（VI）的去除率按下式计算：

U（VI）去除率=C1-C2C1×100%

式中，C1为U（VI）初始浓度；C2为U（VI）残留质量浓度。

1.4 去除U（VI）的微生物组合筛选

将柠檬酸杆菌、耐辐射奇球菌按1∶1比例形成微生物组合，按10%接种量加入TGY培养基中，使得U（VI）初始浓度为30 mg/L，置于转速为120 r/min、温度为30 ℃的恒温振荡培养箱中培养36 h，分析单菌株与组合菌对U（VI）的耐受性。

1.5 去除U（VI）的微生物组合培养条件优化

按接种量10%，柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合与U（VI）作用36 h，以U（VI）去除率为指标，考察菌株组合去除U（VI）的pH、温度、U（VI）初始浓度。

对pH、温度、U（VI）初始浓度3个相互影响因素按L9（34）进行正交试验（表1）。每组试验3个平行样。

2 结果与分析

2.1 U（VI）对微生物生长的影响

为了探索微生物对U（VI）的去除效应，首先需要研究U（VI）对细菌的生長影响情况，使锥形瓶中的U（VI）保持在10、30、50 mg/L，30 ℃，120 r/min振荡培养60 h，每隔12 h取样，于600 nm处测定培养物中的细菌浓度，分别考察微生物在TGY培养基中的生长情况和对不同浓度U（VI）的耐受性。

由图1可知，在U（VI）的胁迫下，菌株OD600均出现明显变化，除考式玫瑰菌外，其他3种微生物均能耐受50 mg/L U（VI）。研究表明，高浓度U（VI）对柠檬酸杆菌的生长有轻微的抑制作用，但与10 mg/L U（VI）作用时明显促进该菌株的生长。柠檬酸杆菌分泌的柠檬酸可能改变原溶液中的pH，刺激该菌株的生长。总的说来，柠檬酸杆菌生长受不同浓度U（VI）的影响较小。

U（VI）对耐辐射奇球菌对数生长期具有较小的影响，但在对数期和稳定期影响不明显。陈立等[10]指出，耐辐射奇球菌对核素的抗性机制归因于DNA损伤的高效修复能力、对活性氧自由基的有效清除能力、自身特殊的基因结构与生存方式3个方面。考式玫瑰菌OD600均低于对照组，在未加入U（VI）的情况下，培养至36 h，其OD600可达到5.97，其生长虽可达到5.04左右，但生物量明显降低。这说明从铀污染区域分离的微生物相对于其他微生物具有明显的生长优势。这可能与它的生存环境相关。

2.2 微生物对U（VI）的去除能力研究

在250 ml锥形瓶中，加入87 ml TGY培养基与10 ml OD值为0.8的XJ1、考式玫瑰菌、耐辐射奇球菌、柠檬酸杆菌菌液，30 mg/L U（VI），培养温度30 ℃，120 r/min振荡培养箱中培养36 h。每隔12 h取样，8 000 r/min振荡5 min，利用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法在652 nm处测量上清液中U（VI）的浓度。每组试验重复3次。

由图2所知，耐辐射奇球菌、柠檬酸杆菌对U（VI）有显著的去除效应，对U（VI）的去除率分别达到80.4%、84.8%，而XJ1、考式玫瑰菌对U（VI）的去除率仅分别为47.6%、35.7%。

柠檬酸杆菌为兼性厌氧菌，直杆状，表面光滑，无荚膜，直径约为1.0 μm，革兰氏阴性菌。Xie等[11]研究表明，柠檬酸杆菌对U（VI）的吸附量可达9 000 mg/g，但研究中当U（VI）浓度为30 mg/L时柠檬酸杆菌对U（VI）的去除率可达84.8%。由此可知，柠檬酸杆菌适合处理低浓度含铀废水[12]。

耐辐射奇球菌为兼性厌氧菌，球状，能产生粉红色色素，革兰氏阳性菌，具有四分体结构。研究中，耐辐射奇球菌对30 mg/L U（VI）的去除率可达到80.4%。与邓钦文等[6]运用耐辐射奇球菌菌体在优化条件下对50 mg/L U（VI）的去除率达92.3%相比，去除率稍低，可能是利用活体微生物去除U（VI）的缘故。相关报道也指出，一些重金属抗性基因已在耐辐射奇球菌中表达[13-16]。

2.3 单菌株与混合菌株对U（VI）的耐受性比较

将筛选得到的两种优势菌株按1∶1比例建立对U（VI）作用的高效组合，设定柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合，考察单菌株与混合菌株对对U（VI）的耐受性。

由图3可知，柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合对30 mg/L U （VI）的抗性明显增加，其生长趋势相对于两单菌株均有增强，说明它为有效组合。由此可知，菌株的生长与U （VI）的去除率保持某种线性关系。因此，推测柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合能提升U （VI）的去除效果。

2.4 去除U（VI）的柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌的正交试验结果分析

影响微生物生长和去除U （VI）的因素较多。试验中，着重考察pH、温度、U（VI）初始浓度对去除U （VI）的影响。

由表2可知，檸檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合去除U（VI）的最佳条件为：pH 6.0、温度30 ℃、U（VI）初始浓度10 mg/L。各因素对柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌去除U（VI）的影响顺序为pH>温度>U（VI）初始浓度。pH相对于温度和U（VI）初始浓度对微生物组合去除U（VI）的影响较大。

对比微生物组合对U（VI）的去除率，温度较之于U（VI）初始浓度对微生物组合去除U（VI）的影响较大。正交试验中，温度30 ℃为去除U（VI）的最适温度，推测温度可能影响细胞上金属吸附位点和增加吸附位点与金属离子的亲和力，或为金属离子在细胞内主动运输提供能量而提升去除效率[17]。U（VI）初始浓度对组合菌去除U（VI）的影响较小。这可能是由于试验中U（VI）浓度较小。

3 结论

在U（VI）的胁迫下，筛选出3种耐受U（VI）的微生物，分别是XJ1、耐辐射奇球菌、柠檬酸杆菌，且均能耐受50 mg/L U（VI）。研究表明，耐辐射奇球菌与柠檬酸杆菌对U（VI）有显著的去除能力，去除率分别达到80.4%、84.8%，而其他2种微生物则对U（VI）的去除能力不强。

运用单菌株和菌株组合的耐受性比较分析，构建了柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合，再通过三因素三水平优化柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌去除U（VI）的pH、温度、U（VI）初始浓度。结果表明，在最佳条件（pH 6.0、温度30 ℃、U（VI）初始浓度10 mg/L）下，柠檬酸杆菌-耐辐射奇球菌组合对U（VI）的去除率可达到98.3%。

参考文献

[1]PRAT O， BERENGUER F， STEINMETZ G， et al. Alterations in gene expression in cultured human cells after acute exposure to uranium salt： Involvement of a mineralization regulator[J]. Toxicology in Vitro， 2010， 24（1）： 160-168.

[2] TAWFIK Z， ABUSHADY M， HAYTHAM M. Uranium uptake by some locally isolated and some reference bacterial species[J]. Acta Pharmaceutica， 2005， 55（1）： 93-105.

[3] 方迪， 王方， 单红仙， 等. 硫酸盐还原菌对酸性废水中重金属的生物沉淀作用研究[J]. 生态环境学报， 2010， 19（3）： 562-565.

[4] 杨晶. 柠檬酸杆菌吸附重金属镉的研究[J]. 水处理技术， 2009（5）： 64-66.

[5] 张花香， 宋金秋， 吴莎莉. 蜡样芽孢杆菌对重金属离子的耐受性及其芽孢吸附能力的研究[J]. 华中师范大学研究生学报， 2005（4）：40.

[6] 邓钦文， 丁德馨， 刘冬， 等. 耐辐射奇球菌对水中铀 （Ⅵ） 的吸附试验[J]. 金属矿山， 2014， 43（1）： 150-153.

[7] 杨晶， 谢水波， 王清良， 等. 微生物吸附铀的机理研究现状[J]. 铀矿冶， 2006， 25（4）： 192-195.

[8] HINOJOSA M B， CARREIRA J A， GARCARUZ R， et al. Microbial response to heavy metalpolluted soils[J]. Journal of Environmental Quality， 2005， 34（5）： 1789-1800.

[9] 张伟， 董发勤， 代群威. 微生物富集铀[J]. 铀矿冶， 2006， 24（4）： 198-202.

[10] 陈立， 董俊兴. 耐辐射奇球菌抗辐射作用的研究进展[J]. 癌变·畸变·突变， 2008（4）：24.

[11] XIE S， YANG J， CHEN C， et al. Study on biosorption kinetics and thermodynamics of uranium by Citrobacter freudii[J]. Journal of Environmental Radioactivity， 2008， 99（1）： 126-133.

[12] 王建龙， 韩英健， 钱易. 微生物吸附金属离子的研究进展[J]. 微生物学通报， 2000， 27（6）： 449-452.

[13] 孙晓宇， 李斌元， 马云， 等. 耐辐射奇球菌的辐射损伤修复机制研究进展[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2012， 30（2）： 71-75.

[14] 周绪斌， 邢瑞云， 吕星.耐辐射奇球菌在放射性环境中的生物修复作用[J]. 微生物学通报， 2004， 31（1）：118-122.

[15] 华跃进， 高冠军. 耐辐射异常球菌 DNA 损伤与修复相关基因的比较基因组研究[J]. 微生物学报， 2003， 43（1）： 120-126.

[16] 赵清， 舒为群. 耐辐射球菌抗辐射机制研究进展及其环境修复应用前景[J]. 应用与环境生物学报， 2008， 14（4）： 578-584.

[17] ANIRUDHAN T S， SREEKUMARI S S. Synthesis and characterization of a functionalized graft copolymer of densified cellulose for the extraction of uranium （VI） from aqueous solutions[J]. Colloids and Surfaces A： Physicochemical and Engineering Aspects， 2010， 361（1）： 180-186.