油茶树根际土壤解有机磷细菌的分离、鉴定及解磷能力分析

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摘 要：为了获得高效解有机磷细菌，从油茶植株根际土壤中分离到21株解有机磷细菌，采用透明圈法进行复筛，仅有4株细菌能在有机磷培养基上形成明显的透明圈。4株细菌的D/d值在1.62～2.71之间，其中菌株Y6的D/d值最大，为2.71;发酵上清液有效磷含量为8.50～14.79 mg/L，较CK增加7.88～14.17 mg/L，其中菌株Y6发酵上清液有效磷含量最多，为 14.79 mg/L，较CK增加14.17 mg/L。根据菌株Y6的菌落形态特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，初步确定菌株Y6为假单胞菌属。该菌株有利于改善油茶磷素供应，促进油茶生长，在生物有机肥研制中具有较大潜力。

关键词：解有机磷细菌;假单胞菌;有效磷;油茶

中图分类号：S154.3文献标识码：A文章编号：1006-060X（2019）10-0008-04

Abstract： In order to obtain high-efficiency organophosphate-dissolving bacteria， 21 strains of organophosphate-dissolving bacteria were isolated from the tea-oil rhizosphere soil， and the transparent circle method was used for rescreening. Only 4 bacteria could form obvious transparent circles on the organic phosphorus medium. The D/d values of the four bacteria ranged from 1.62 to 2.71， and the strain Y6 had the largest D/d value of 2.71. The effective phosphorus content of the fermentation supernatant was 8.50-14.79 mg/L， which was 7.88-14.17 mg/L higher than that of CK. The strain Y6 had the highest soluble phosphorus content of 14.79mg/L in the fermentation supernatant， which was 14.17mg/L higher than CK. According to 16S rDNA sequence analysis， morphological， physiological and biochemical characteristics， strain Y6 was initially identified as Pseudomonas. Strain Y6 is beneficial to improving the supply of phosphorus in tea-oil rhizosphere soil and promoting the growth of tea-oil tree. It has great potential in the development of bio-organic fertilizer.

Key words： organophosphate-dissolving bacteria; Pseudomonas; effective phosphorus; tea-oil tree

磷是植物生长所需的主要营养元素之一。农田土壤中全磷的含量高，但是有效磷的含量却很低。这是因为土壤中的磷主要是以难溶性的化合物存在，绝大部分不能被植物直接吸收利用。我国有74%的耕地土壤存在缺磷现象[1]，有机态磷约占土壤全磷量的20%～50%[2]。通常采用施用化学磷肥的方式提供植物所需的磷元素，但是化学磷肥利用率很低，通常只有 5%～25%[3]。解磷菌能将难溶性或不溶性磷转化为植物可利用的形态，提高土壤中磷元素的利用率。林启美等[4]通过对农田、草坪、林地和菜地根际土壤溶磷微生物数量和种群结构的研究，发现有机磷细菌主要为芽孢杆菌属，其次是假单胞菌属。

油茶是我国所特有的世界4大木本油料树种之一[5]。截至2018年末，湖南省油茶林总面积达到140.74万hm2，茶油总产量26.2万t，产值450亿元，居全国首位[6]。茶籽油中含有单不饱和脂肪酸——油酸，能够降低血液中胆固醇和低密度脂蛋白的浓度，预防心血管疾病的发生[7]。研究表明，油茶根际土壤中存在溶磷菌，可以改良土壤理化性质，促进植物生长，增加作物产量，对生态环境友好[8]。

课题组从健康的油茶植株根际土壤采样，分离获得一批可分解有机磷的菌株，从中筛选出一株高效解有机磷细菌，对其解磷能力进行了分析，通过菌落形态特征和生理生化特征以及16S rDNA序列分析，初步确定菌株的分类地位，为微生物肥料的研制提供理论依据，进而达到减少化肥施用量、提高产品质量、降低生产成本的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 采集邵阳市油茶林健康的油茶植株根際土壤，置于阴凉处自然风干后于4℃的冰箱内保存备用。

1.1.2 培养基 （1）有机磷培养基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0 g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20 g，dd H2O 1 000 mL，pH值7.0～7.5。（2）LB培养基参见文献[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 解有机磷细菌的分离纯化 称取10 g根际土壤加入90 mL无菌水中，180 r/min摇床振荡30 min;静置1 min后取悬浮液依梯度稀释至10-5，分别从10-3、10-4、10-5各吸取100 µL加入至有机磷培养基平皿中，涂布均匀，倒置于30℃恒温箱中培养3～7 d;挑取周围有透明圈的单菌落，划线纯化3～5代，获得纯菌株后接种到LB斜面培养基上，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 解有机磷细菌的复筛 采用溶磷圈法，将待测菌株点接于有机磷培养基平皿中，每个菌株3个重复，30℃恒温箱中培养4 d，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），根据D/d值大小初步确定菌株的解磷能力。

1.2.3 解磷能力分析 将待测菌株接种于50 mL液体有机磷培养基中，每个菌株3个重复，以不接种的空白液体有机磷培养基为对照，180 r/min，30℃恒温摇床振荡培养4 d。培养液在4℃下10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释适当倍数后用钼锑抗比色法测有效磷含量。

1.2.4 解有机磷细菌的鉴定 （1）菌株的形态学鉴定：待测菌株划线接种于LB培养基，置于30℃恒温箱中培养48 h，观察并记录菌落形状、透明度、大小、色素、生长速度、边缘特征等，革兰氏染色，光学显微镜镜检。（2）菌株的生理生化特征：按照《常见细菌系统鉴定手册》[10]中的方法进行鉴定。（3）菌株的16S rDNA 序列分析：按照试剂盒说明书提取菌株DNA，采用细菌通用引物27F/1492R进行16S rDNA 的PCR扩增。（4）PCR反应条件： 95℃预变性10 min;94℃变性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸90 s，循环30次;最后72℃延伸10 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，序列通过Blast程序与GenBank数据进行比对，选择同源性高的序列使用MEGA5.1软件构建系统发育树，确定其分类地位。

1.2.5 解有机磷细菌发酵液有效磷含量与pH值的关系 待测菌株在LB培养基平皿活化后，接种于有机磷液体培养基中，30℃下以180 r/min振荡培养，分别于12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h取样，用酸度计测定发酵液pH值，用钼锑抗比色法测定有效磷含量。

1.2.6 解有机磷细菌生长曲线的测定 待测菌株在LB培养基平皿活化后，接种于LB液体培养基，500 mL三角瓶装液量为100 mL，30℃下以180 r/min恒温振荡培养，每隔2 h取样一次，用紫外分光光度计测定发酵液在波长600 nm处的OD值，绘制生长曲线。

1.2.7 数据处理 试验数据采用 Excel 软件进行整理，采用SPSS 17.0统计分析软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 解有机磷细菌的分离纯化

有机磷培养基平皿上共分离到21株有透明圈的菌株，分别命名为Y1～Y21，划线纯化3代，获得纯培养物后接种到LB斜面培养基上，置于4℃冰箱中保存备用。

2.2 解有机磷细菌的复筛

对初步分离到的21株细菌进行复筛，结果只有Y3、Y6、Y11、Y12这4株细菌能在有机磷培养基上形成明显的透明圈（图1）。从表1可知，4株细菌的D/d值在1.62～2.71之间，其中菌株Y6的透明圈直径（D）为24.9 mm，菌圈直径（d）为9.2 mm，D/d值最大，为2.71。4株细菌的D/d值从大至小排列依次为Y6>Y12>Y11>Y3。

2.3 解有机磷细菌的解磷能力

4株细菌Y3、Y6、Y11、Y12在30℃恒温摇床振荡培养4 d后，发酵上清液有效磷含量分别为10.37、14.79、8.50、9.49 mg/L，分别比CK增加9.75、14.17、7.88、8.87 mg/L，增加倍数在12.71～22.85倍之间;4株细菌发酵上清液有效磷含量由高到低排列依次为Y6>Y3>Y12>Y11，各菌株之间以及菌株与CK之间的差异均达显著水平;其中，菌株Y6的发酵上清液有效磷含量最高，为14.79 mg/L，是CK的23.85倍，选择该菌株进行下一步试验。

2.4 解有机磷细菌的鉴定

2.4.1 菌株的形态学鉴定 菌株Y6在LB培养基上为圆形菌落，白色，不产生色素，粘稠。显微镜观察，菌体呈直杆状，不产芽孢，为革兰氏阴性菌。

2.4.2 菌株的生理生化特征 菌株Y6能利用葡萄糖、木糖发酵产酸，不能利用甘露醇、蔗糖发酵产酸，不能水解淀粉，不能利用丙二酸，V.P.试验呈阴性，甲基红试验呈阴性，能液化明胶，接触酶试验呈阳性。

2.4.3 菌株的16S rDNA 序列分析 将菌株Y6的16S rDNA 序列提交至GenBank中进行同源性检索，Y6与Pseudomonas arsenicoxydans（VC-1）的同源性为99%，选择与Y6的16S rDNA 序列相似性较高的菌株用MEGA5.1软件邻接法建立系统发育树，结果如图2所示，根据菌株Y6的菌落形态特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，初步确定菌株Y6為假单胞菌属。

2.5 菌株Y6发酵液有效磷含量与pH值的关系

由图3可知，随着菌株Y6发酵液pH值的逐步降低，发酵上清液有效磷含量逐步增加，培养108 h后发酵液pH值为6.4，发酵上清液有效磷含量达最大值，为17.11 mg/L;随着培养时间的增加，pH值继续降低，发酵上清液有效磷含量逐步降低，培养144 h后发酵液pH值稳定在6.01，发酵上清液有效磷含量为13.96 mg/L。这说明菌株Y6发酵液pH值的变化不是其解有机磷的必要条件。

2.6 解有机磷细菌Y6的生长曲线

微生物的生长曲线，可以分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段。从图4可以看出，在LB液体培养基中，菌株Y6的延缓期在4 h以内，4 h后OD600值迅速增加，进入对数生长期，22 h后OD600值达到最大，为5.21，随后进入稳定期，并保持相当长时间。

3 结论与讨论

目前，解有机磷细菌的分离，主要以卵磷脂作为单一的有机磷来源，解有机磷细菌分泌的磷酸酶将卵磷脂分解为胆碱、甘油、脂肪酸、磷酸，胆碱被进一步分解为胺、有机酸、二氧化碳、醇，最终在有机磷培养基上形成透明圈[11]。课题组从健康的油茶植株根际土壤采样，共分离到21株在有机磷培养基上有透明圈的菌株，采用溶磷圈法进行复筛，仅有4株细菌能在有机磷培养基上形成明显的透明圈，其余17株菌没有透明圈，失去解磷现象。Venkateswarlu 等[12]也报道过大多数解磷细菌经过几次传代培养后，会失去解磷能力。

30℃恒温箱中培养4 d，4株细菌的D/d值在1.62～2.71之间，其中菌株Y6的透明圈直径（D）为24.9 mm，菌圈直径（d）为9.2 mm，D/d值最大，为2.71。D/d比值的大小只是说明细菌具有解磷能力，不能判定细菌解磷能力的大小，很多学者有类似的观点[13-14]。

4株细菌在30℃恒温摇床振荡培养4 d后，发酵上清液有效磷含量为8.50～14.79 mg/L，CK上清液有效磷含量为0.62 mg/L，上清液有效磷增加量为7.88～14.17 mg/L，其中菌株Y6发酵上清液有效磷含量最高，为 14.79 mg/L，较CK增加14.17 mg/L。4株细菌的D/d值从大至小排列依次为Y6>Y12>Y11>Y3，而4株细菌发酵上清液有效磷含量由高到低排列依次为Y6>Y3>Y12>Y11，表明解磷细菌D/d 值和发酵上清液有效磷含量之间并不总是呈正相关，这与伍善东等[15]的研究结果一致。

菌株Y6的发酵液pH值随着培养时间的增加逐步降低，培养144 h后发酵液pH值稳定在6.01。发酵上清液有效磷含量先升高后降低，培养108 h后发酵上清液有效磷含量达最大值，为17.11 mg/L，说明菌株Y6发酵液pH值的变化不是其解有机磷的必要条件。赵小蓉等[16]的研究表明，发酵液有效磷含量与培养液pH值存在一定的相关性，但是培养液pH的下降，并不是解磷的必要条件，对此，很多学者也发现二者的相关性较为微弱[17-18]。发酵培养液pH值的下降与解磷菌分泌有机酸有关，H+还有其他来源，如NH4+/H+交换机制和呼吸作用。目前，认为解有机磷细菌分泌磷酸酶是主要的解磷机理之一，张淑红[19]认为解有机磷细菌分泌的有机酸、蛋白质和多糖可能也具有一定的溶磷效果。

根据菌株Y6的菌落形态特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，初步确定菌株Y6为假单胞菌属。

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（责任编辑：成 平）