两种粉虱Hsp60基因的克隆与表达

摘要：以近缘昆虫Hsp60基因保守区域设计兼并引物，PCR扩增烟粉虱（Bemisia tabaci）地中海（MED）隐种与温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）Hsp60基因cDNA，并检测了Hsp60基因受温度影响的表达情况。结果表明，烟粉虱MED隐种Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 821 bp， 编码607个氨基酸；温室白粉虱Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 788 bp， 编码596个氨基酸，Hsp60基因在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。温室白粉虱Hsp60基因表达量受温度影响显著（P<0.05），而烟粉虱MED隐种则不显著（P>0.05）。

关键词：烟粉虱（Bemisia tabaci）地中海（MED）隐种；温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）；Hsp60基因；耐热性

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5339-03

Cloning and Expression of Hsp60 Gene in Two Whitefly

GUO Li-li，XIAO Lin-yun，YU Hao，WANG Yun-bing

（School of Resource and Environment Science，Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China）

Abstract： Primers were designed based on the reported sequences of conservative regions of Hsp60 gene family in other insects， and the fragments isolated from the two whitefly were amplified by PCR and the full-length cDNA sequences were obtained by sequence assembly. The full-length cDNA of Hsp60 of the two whitefly contained 1 821 and 1 788 bp， open reading frame（ORF） encoded 607 and 596 amino acids， respectively. Meanwhile， the results showed that the Hsp60 presented good phylogenetic informativeness at both low and high taxonomic levels in insect. Trialeurodes vaporariorum Hsp60 gene expression was found significantly affected by temperature（P<0.05）， but Bemisia tabaci MED was not signficant（P>0.05）.

Key words： Bemisia tabaci MED； Trialeurodes vaporaiorum； Hsp60 gene；heat resistance

目前，已发现的导致水生动物感染水霉病的真菌有水霉属（Saprolegnia）、绵霉属（Achlya）、细囊霉属（Leptolegnia）、丝囊霉属（Aphanomyces）、腐霉属（Pythium）和异霉属（Allomyces）的13 种真菌，其中以水霉、绵霉、细囊霉和丝囊霉最为常见，也最为容易导致水霉病的大面积蔓延和流行。传统的真菌病原菌分类主要根据其感染部位、体外培养的形态、生理生化指标以及有性生殖过程的形态特征等。但这些鉴定方法主观性强、程序繁琐、重复性差、周期很长，且形态特征易受环境等因素的影响，加上稳定性和分类能力上受到很多限制，因此往往很难能鉴定到种。随着对卵菌纲生物的形态学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的深入研究，推动了水霉菌分类鉴定的发展。在基础分子生物学和临床医学的研究中，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术被认为是应用最为广泛的方法之一。聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离、鉴定及其结构与功能的分析，该方法操作简便、快捷、较为常用，可为不同水霉菌菌株的分类提供技术手段[1]。

研究表明外膜蛋白是真菌外膜中的蛋白成分，外膜蛋白结构相对稳定，遗传突变性小，且种间差异明显，因此外膜蛋白常用于研究细菌性和真菌性病原菌株的流行病学特征。因此，本研究对水霉菌外膜蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较分析了外膜蛋白，可为真菌的致病性和流行病学的研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

水霉菌分别分离[2]于湖北、广州、上海等地区患水霉病的淡水养殖水生动物病变组织（表1）；标准菌株ATCC 200013为国家水生动物病原库提供。

1.2 菌丝培养

试管斜面活化后，接入PDA平板内，20 ℃培养24～36 h，然后转接入9 cm铺有玻璃纸的平板内，平板培养基为PDAY（PDA+0.2%酵母膏）。每皿接入5 mm2的小菌块4～5块，均匀分布于玻璃纸表面，20 ℃培养36～48 h，小心取出接种菌块。用刀片从玻璃纸表面刮取菌丝，收集于小培养皿中，真空干燥12～24 h，分装于1.5 mL离心管中-20 ℃保存备用[3]。

1.3 破壁处理

采用3种方法对水霉菌进行破壁处理。方法1：取1.0 g菌丝体，加10 mL 1×PBS缓冲液，振荡混匀，加石英砂100 mg，研磨20 min，成糊状。方法2：取1.0 g菌丝体，液氮研磨，成白色粉末状，加10 mL 1×PBS缓冲液，振荡混匀。方法3：取1.0 g菌丝体，加石英砂100 mg，再加液氮研磨成白色粉末状，加10 mL 1×PBS缓冲液，振荡混匀[4]。

1.4 样品制备

3种破壁方法处理后得到的处理液分别于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液，加1倍体积预冷的丙酮，置于-20 ℃过夜，然后4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集沉淀，用1 mL ddH2O溶解蛋白质沉淀，置于-20 ℃保存备用。

1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶浓度为5%（pH 6.8），分离胶浓度为10%（pH 8.8），指示剂为溴酚蓝，电泳缓冲液为1×Tris-Gly缓冲液（pH 8.3），加10%SDS。取5 μL蛋白质样品，加1倍体积2×上样缓冲液（含20%DDT）；样品煮沸5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳在冰浴中进行，当溴酚蓝距胶底2 cm左右时停止电泳。

1.6 染色

取出凝胶，置于过滤后的考马斯亮蓝染色液（含0.2%考马斯亮蓝R-250、10%冰醋酸、50%甲醇）中，室温下摇床缓慢旋转，1 h后将凝胶浸入考马斯亮蓝脱色液（含30%甲醇、10%冰醋酸）中，室温下摇床缓慢脱色，脱色数次直至蛋白质条带出现、背景干净为止。

2 结果与分析

2.1 菌丝体蛋白制备方法的比较

利用3 种不同组合的方法制备水霉菌株可溶性菌丝体蛋白，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。从图1可以看出，方法3制备的蛋白较方法1和2完整，显带最多、清晰；方法2制备的蛋白较方法1完整，条带较多且较清晰；方法1比方法2和方法3的条带少且不清晰，效果最差。

2.2 水霉菌株蛋白条带的差异分析

从图2可以看出，02和LP条带基本一致，S2、L5条带基本一致，AT、CP和S1条带基本一致，04和14条带基本一致。聚丙烯凝胶电泳能够有效地区分不同种类的水霉菌，能够为水霉菌株分类提供可靠的分类技术。

3 小结与讨论

3.1 蛋白制备方法分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定、纯化蛋白质的方法之一，是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子，凝胶内部是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，很少带有离子侧基，因而电渗作用小，不易与样品相互作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子质量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开[5，6]。本试验通过不同的破壁处理方式来探究蛋白制备方法的差异性，从而筛选出较好的制备方法，方法3的制备效果明显好于方法1和方法2，表明蛋白质的制备效果受诸多因素的影响，在选择SDS-PAGE电泳方法时，必须根据自己的研究对象（物种）、研究目的（蛋白质的分子质量范围）和蛋白质的制备方法等因素进行比较和优化，才能从中筛选出最佳制备方案。

3.2 水霉菌株种间差异分析

研究表明外膜蛋白型结构相对稳定，遗传突变性小，且种间差异明显[5-7]，因此外膜蛋白分析常用于研究细菌性和真菌性病原菌株的流行病学特征。本研究中菌株02和LP条带基本一致，说明采集不同地方的菌株有可能菌株相似，S2、L5条带基本一致，以及04和14条带基本一致，说明采集相同地域的菌株，菌株之间有很大的相似性，AT、CP和S1条带基本一致，这与王素英等[8]、牛桂兰等[9]提出可以通过比较未知菌株与标准菌株外膜蛋白型的相似性来确定真菌种类的方法一致，表明聚丙烯酰胺凝胶电泳技术能够区分水霉，从而达到为水霉菌株的分类鉴定提供技术手段。

参考文献：

[1] 杨 平，钟 剑，雷 帆，等. 丝状真菌Pythium sp.GY1938菌株蛋白图谱染色方法的比较及优化[J].中国病原生物学杂志，2011，6（9）：675-678.

[2] 夏文伟，曹海鹏，王 浩，等.彭泽鲫卵源致病性水霉的鉴定及其生物学特性[J].微生物学通报，2011，38（1）：57-62.

[3] 曾大兴. 适于RAPD分析的真菌DNA提取方法[J]. 生物技术，2003，13（2）：20-21.

[4] 万其兵，刘丽丽，杨秀英.真菌细胞破壁方法的研究[J].天津师范大学学报（自然科学版），2004，24（4）：38-40.

[5] 孙建和，严亚贤，陈怀青，等. 致病性嗜水气单胞菌保护性抗原的研究[J]. 中国人兽共患病杂志，1997，13（3）：20-23.

[6] 高 崧，刘秀梵，张如宽.我国部分地区禽源大肠杆菌的外膜蛋白型[J]. 微生物学报，1999，39（3）：226-233.

[7] MARIA M N， SUSANA M， ALICIA A， et al. Cloning， sequencing， and role in serum susceptibility of porin II from mesophilic Aeromonas hydrophila[J]. Infection and Immunity，2000，68（4）：1849-1854.

[8] 王素英，杨晓丽.全细胞蛋白聚类分析的可行性[J]. 华中师范大学学报（自然科学版），2000，31（1）：88-91.

[9] 牛桂兰，汤显春，刘进学，等.金矿床区蜡状芽孢杆菌孢壁蛋白SDS-PAGE图谱及聚类分析[J].微生物学杂志，2002，22（2）：24-25.