HPLC法测定离体葡萄叶中茋化物的含量

摘要：采用HPLC法测定新疆红提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香无核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）离体葡萄叶片中的白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋、ε-二聚体葡萄素4种茋化物的含量。结果表明，4种茋化物的线性关系良好，相关系数为0.999 0～0.999 3，平均回收率为90.2%～109.2%。新疆红提和紫香无核离体葡萄叶片中4种茋化物含量不同，红提葡萄叶茋化物含量相对较高，其中白藜芦醇苷含量最高达23.73 μg/g。2种葡萄叶的茋化物含量依次均为白藜芦醇苷>紫檀茋>白藜芦醇>ε-二聚体葡萄素。高效液相色谱法灵敏度高，适用于葡萄叶中4种茋类化合物含量测定。

关键词：新疆红提（Vitis vinifera cv. Red globe）；紫香无核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）；茋化物；离体葡萄叶；高效液相色谱法

中图分类号：S132；O945.78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2411-03

茋类化合物是具有均二苯乙烯母核或其寡聚物一类化合物的总称。1976年，Langcake和Pryce首次发现葡萄（Vitis riparia）的叶片受紫外线照射、机械损伤及真菌感染时白藜芦醇会迅速增加，认为白藜芦醇是在逆境或遭遇到病原侵害时分泌的一种植保素[1]。近年来，研究证实葡萄、花生、虎杖等植物材料中不但含有白藜芦醇，而且含有云杉苷、ε-二聚体葡萄素（ε-viniferin）、紫檀茋等其他茋类化合物[2，3]。作为植保素的重要组成成分，茋类化合物除了能提高植物的抗病性外，还具有较好的药理活性，譬如调脂、保肝、抗血栓和抗肿瘤作用[4]，而其中的白藜芦醇则具有抗衰老、皮肤保健和美容功效[5，6]，其药用价值受到广泛关注。目前，白藜芦醇主要通过植物提取、化学合成和植物组织细胞培养等方法获得，其中从植物中提取的白藜芦醇天然安全，符合人们“绿色消费”的要求。因此，天然白藜芦醇具有广阔的应用前景。

新疆葡萄资源极为丰富，为保证果实品质，葡萄种植期间需要多次除去植株外周叶，其中以采摘葡萄后越冬除叶操作产生的废弃叶为最，每亩地最多可产生成吨葡萄叶。因此，葡萄叶作为茋类化合物的新资源，不仅具有较大的开发潜力，还可提高葡萄产业的附加值。但另一方面，利用HPLC法同时对多种茋类化合物检测时常受到植物多酚的干扰，样品需要液液萃取[7，8]等前处理，目前采用乙醇提取法，安全低毒，且可提取多种茋类化合物[9]。本研究通过超声辅助提取和HPLC法，建立葡萄叶片中白藜芦醇、白藜芦醇苷、紫檀茋、ε-二聚体葡萄素4种茋类化合物的快速分析方法，为葡萄叶片的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采摘石河子秋季生长健壮、长势一致的美国红提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香无核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）的后期中间叶龄葡萄叶片（含叶柄，大小相近），用去离子水洗净，在暗室中用1∶10（V/V）去离子水浸泡12 h，沥干，置于-80 ℃冰箱保存，备用。

白藜芦醇（resveratrol，Res），白藜芦醇苷（polydatin，PD）、紫檀茋标样（Pterostilbene，PS）购于Sigma公司，纯度≥98%；ε-二聚体葡萄素（ε-viniferin，ε-VF）购于云力西公司，纯度≥98%。

95%（体积分数）乙醇，购于天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器

LC-15C型高效液相色谱仪（日本岛津公司），KQ5200DE型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂），AB1042N型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），SB-1000型旋转蒸发仪 （上海爱朗仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 前处理 取冷冻紫香无核和红提叶，迅速粉碎研磨，分别称取5 g于烧杯中，加100 mL 70%（体积分数）乙醇[10]，超声提取3次，合并提取液，浓缩干燥。用甲醇定容至10 mL后，过0.25 μm微孔滤膜，待测。

1.3.2 标准溶液的配制 分别称取Res 1.2 mg，PD 1.9 mg，PS 1.3 mg和ε-VF 2.3 mg，定容至10 mL，配制成525、487、507、506 mmol/L的标准母液，备用。

1.3.3 色谱条件 色谱柱Atlantis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃，检测波长为306 nm，进样体积为20 μL。采用二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为去离子水（2‰磷酸，体积分数）；起始0.01 min时A为5%（体积分数，下同），B为95%；到20 min时A为15%，B为85%；50 min时A为30%，B为70%；到65 min时A为70%，B为30%；到70 min时停止。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

PD、Res、PS、ε-VF标准品的保留时间分别为34.247、45.579、58.561和64.583 min；标准品色谱图和样品提取液色图谱分别见图1A和图1B。由图1可知，本法可同时检测样品中的PD、Res、PS和ε-VF。

2.2 线性关系考察

精确吸取1～7 μL不同体积4种标准溶液，定容于10 mL，分别配成5～35 μmol/L标准工作液，记录色谱图及峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程，结果如表1所示。4种茋化物峰面积和浓度的相关系数为0.999 0～0.999 3，表明在设定浓度范围内，线性关系良好。

2.3 方法学分析

精密度试验：精确吸取一定量的标准母液，配制成500 μmol/L 工作液，每次进样20 μL，连续进样6次，计算峰面积RSD值。重复性试验：精确称取提同一样品粉末6份，按供上述前处理和色谱分析方法平行操作，计算峰面积RSD值。稳定性试验：取同一供试品溶液，每隔2 h进样20 μL，共5次，计算峰面积RSD值，结果见表1。

2.4 回收率试验

分别取冷冻发脆的葡萄叶片，粉碎研磨样分为4份，1份直接测定，另外3份分别加入3个水平的Res、PD、PS和ε-VF标准品，每水平设3平行，考察本法回收率，结果见表2。由表2可知，该方法回收率为90.2%～109.2%，表明精密度良好。

2.5 不同品种葡萄叶样品中茋类化合物含量比较

紫香无核葡萄叶、红提葡萄叶中茋类化合物含量如表3所示。由表3可知，红提PD的平均含量最高（23.73 mg/kg），紫香无核中ε-VF最低（1.05 mg/kg）。

3 小结与讨论

一般条件下，葡萄中茋类化合物水平较低，新鲜葡萄皮中大约含50～100 mg/kg白藜芦醇以及少量虎杖苷和白皮杉醇，红皮葡萄中相关化合物含量较高。而葡萄藤茎中含有微量顺式白藜芦醇（3.5 μg/kg）及ε-viniferin（1.3 μg/kg），葡萄果肉中茋类化合物含量极低。葡萄叶片中含有少量的白藜芦醇（0.06～46 mg/kg），且变化范围较大。Park等[11]测定了葡萄叶片、种子、果皮等部位白藜芦醇含量，发现叶片白藜芦醇含量最高。Landrault等[12]与Bavaresco[13]发现葡萄叶、茎、果实中一些特殊活性的茋类化合物具潜在利用价值。另外，还有报道称红皮葡萄中白藜芦醇的含量相对较高[14]。本研究比较了离体红提和紫香无核叶片中的茋类化合物含量，发现红提葡萄叶中茋类化合物含量高于紫香无核中的含量，该结果表明茋类化合物含量与品种有密切联系。不同品种的茋类化合物含量虽然有差异，但各组分含量大小也呈现一定规律性，如白藜芦醇苷>紫檀茋>白藜芦醇>ε-二聚体葡萄素。上述结果表明在不同葡萄叶中茋类化合物积累的共性与个性特点。

综上所述，本研究针对采摘后离体葡萄叶片中代表性茋类化合物，采用HPLC法对其进行分析，方法简单、干扰小、灵敏度高、分析速度快，适用于葡萄叶中4种茋类化合物的同时快速检测，为探讨新疆北疆常见食用葡萄（美国红提、紫香无核）中的茋类化合物含量提供参考。

参考文献：

[1] LANGCAKE P， PRYCE R J. The production of resveratrol by Vitis vinirera and other members of the vitaccae as a response to infection or injury[J]. Physio Plant Path，1976，9（1）：77-86.

[2] PEZET R， PONT V. Identification of pterostilbene in grape berries of Vitis vinifera[J]. Plant Physiol Bioch，1988（26）： 603-607.

[3] PEZET R，PERRET C， JEAN DENIS J B， et al. δ-Viniferin， a Resveratrol Dehydrodimer： One of the Major Stilbenes Synthesized by Stressed Grapevine Leaves[J]. J Agric Food Chem， 2003， 51（18）： 5488-5492.

[4] JEANDET P，BESSIS R，MAUME BF， et al. Effect of enoiogical practices on the resveratrol isomer content of wine[J]. Agric Food Chem，1995，43（2）：316-319.

[5] 郜海燕，于震宇，陈杭君，等. 白藜芦醇功能和作用机理研究进展[J]. 中国食品学报，2006，6（1）：411-416.

[6] 韩晶晶，刘 炜，毕玉平. 白黎芦醇的研究进展[J]. 生物工程学报，2008，4（11）：1851-1859.

[7] JEANDET P， DOUILLET BREUIL A C， et al. HPLC analysis of grapevine phytoalexins coupling photodiode array detection and fluorometry[J]. Anal Chem，1997，69（24）：5172-5177.

[8] MORENO-LABANDA J F，MALLAVIA R，PEREZ-FONSL，et al. Determination of piceid and resveratrol in Spanish wines deriving from Monastrell （Vitis vinifera L.） grape variety[J]. J Agric Food Chem，2004，52（17）：5396-5403.

[9] 周焕霞，秦 杰，文连奎. 微波辅助提取花生红衣中白藜芦醇工艺的研究[J]. 农产品加（学刊），2010，2（199）：26-29.

[10] 王世盛，赵伟杰，刘志广.天然多羟基芪类化合物的生物活性[J].国外医药（植物药分册），2001，16（1）：9-11.

[11] PARK H， KO JM， AN NR， et al. Contents of trans-resveratrol in Korean grape cultivars， including ‘Kyoho’[J]. Plant Biol，2009，52（4）：319-324.

[12] LANDRAULT N， LARRONDE F， DELAUNAY J C， et al. Levels of stibene oligomers and astilbin in French varietal wines and in grapes during Noble Rot development[J]. Agric Food Chem，2002，50（7）：2046-2052.

[13] BAVARESCO L. Role of viticultural factors on stilbene concentrations of grapes and wine[J]. Drugs Exp Clin Res，2003， 29（5-6）：181-187.

[14] 陈镇泉，林娇健，陈君琛，等. 科学新发现与葡萄新品种[J]. 葡萄栽培酒，1997（3）：54-561.