白木香枝枯病病原菌的鉴定

计划项目（2011BAI01B07）；北京市自然科学基金项目（6102024）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（2008）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20091106120009）；海南省中药现代化专项项目（2010ZY001， 2012ZY002）；海南省重大科技研发专项（ZDZX20100006）

[通信作者] *魏建和，研究员，Tel：（010）57833358， E-mail：wjianh@263.net

[作者简介] 张争，Tel： （010）5783363，E-mail：zhangzheng321@126.com

白木香Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg，又称土沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是中国生产名贵芳香类药材沉香的主要植物来源，现已被列为国家二级濒危保护植物^[1]。健康的白木香树体不能产生沉香类物质，树体必须受到各种物理、化学伤害或真菌侵染后才能够产生沉香^[2-5]。关于真菌侵染结香，国内研究主要集中在黄绿墨耳菌Melanotus flavolivens （Berk. & M.A. Curtis） Singer对白木香的侵染。20世纪70年代华南植物研究所分离得到该菌株，并认为其能够诱导白木香结香^[6-7]。国外报道侵染菌主要有色二孢Diplodia sp.、镰孢Fusarium sp.、曲霉Aspergillus sp.、毛霉Mucor sp.、青霉Penicillium sp.、木霉Trichoderma sp.、裂褶菌Schizophyllum sp.等^{[2， 8]}。2008年8月，笔者在广东电白县、海南屯昌县、海口市等地发现白木香枝枯病发生严重，还发现导致枝枯病的致病菌也可诱导白木香产生沉香，但导致白木香发生枝枯病的病原菌一直没有报道。本研究通过对病原菌形态学的观察和核糖体DNA ITS序列分析来确定其病原菌的种类，并通过柯赫氏法则验证该病原菌能否寄生白木香并产生沉香。

1 材料

Taq DNA聚合酶，dNTPs，DL2000 DNA Marker购自大连TaKaRa公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根公司，引物由上海生工公司合成。其他常规试剂均为进口或国产分析纯。

日本Olympus公司的BX51显微镜，德国Biometra公司Tgradient扩增仪，美国Sigma公司1-14型离心机，美国Bio-Rad公司Gel Doc 2000型凝胶成像系统及Bio-Rad公司的PowerPac Universal稳压稳流电泳仪等。

2 方法

2.1 病害的调查 2008，2009年，在海南省海口市兴隆镇白木香Aquilaria sinensis种植基地定时观察其枝枯病发生情况。

2.2 病原菌的分离和保藏 分离材料采自发病林地的植株。采用病健交界处组织分离法^[9]，取鲜带褐斑枝条5～10 cm，切取病健交界处茎组织，剪成3 mm×3 mm小块。75%乙醇处理2 min，0.1%升汞表面消毒1 min，再在无菌水中洗涤4次，用灭菌滤纸吸干，置于PDA培养基平板上25 ℃黑暗培养。待长出菌落后，通过挑取菌丝尖端方法对分离的病原菌进行纯化。纯化后的病原菌，保存在含液体石蜡的PDA斜面试管中。

2.3 可可毛色二孢的培养性状 取直径10 cm培养皿，加入20 mL PDA培养基制成平板，于平板中央接种一直径为7 mm的菌落边缘菌丝块，观察不同天数可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae的菌落特征。

2.4 枝枯病菌基因组DNA提取 分离于白木香上的枝枯病菌基因组DNA提取参见文献[10]方法。

2.5 白木香枝枯病菌rDNA ITS区序列扩增及分析 采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS l（5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）^[11]，扩增该病菌5.8S rDNA及其两侧的ITS1和ITS2基因片段。反应体系为：总反应体系20 μL，模板DNA 5 ng，引物各10 pmol·L^-1，dNTP 250 μmol·L^-1，MgCl₂2 mmol·L^-1，Taq DNA聚合酶1.0 U。反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后一步延伸5 min。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，纯化后的PCR产物克隆至pGEM-T-easy载体（Promega公司，美国），由上海生物工程技术服务有限公司完成测序。将该真菌的ITS序列在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行同源性比较（BLAST），分析和确定其分类地位。

2.6 病原菌致病性试验 参照文新等^[12]茎基部打孔创伤接种法（稍有修改）进行。2009年8月将3个供试菌株分别在PDA平板上25 ℃黑暗培养5 d。选取三年生健康白木香茎，用直径4 mm的木塞打孔器，旋至木质部，取出树皮，洞内接种与之相同大小的PDA菌丝块（菌丝面向内），将树皮盖回并按压，使菌丝充分与寄主组织接触，野外接种时用塑料带包扎保湿3 d。每菌株接种10根枝条，以接种无菌的PDA培养基块为对照。

2.7 沉香药材鉴别试验 参照《中国药典》（2010年版）^[13]对接种可可毛色二孢1个月的白木香枝条药材进行显微鉴别和浸出物显色鉴别。

2.8 导管填充物扫描电镜试验 方法参照张兴丽等^[14]的方法进行。将固定液中备用的三年生树干取出，沿横、径、弦3面修成厚约2 mm的薄片，在FAA固定液中继续固定4 h后，在室温下至完全干燥，用导电胶将样品粘贴于样品台上，用离子溅射仪（JFC-1600，日本）在30 mA，3 min条件下喷白金（Pt）膜后在SEM（JSM 6510LV，日本）5 kV加速电压下进行观察拍照。

3 结果与分析

3.1 病害调查及其病原菌分离 2008和2009年的观察，白木香枝枯病5—6月零星发生，7—8月的高温季节为盛发期，9—10月进入枯死高峰期。病斑常在主干下部分叉处出现，初期为圆形、水渍状、灰褐色；中期扩展成段斑，黑褐色；后期凹陷、缢缩、开裂。病原菌能够侵入木质部，在导管中迅速扩展。待病部韧皮部都坏死后，引起枝叶干枯死亡（图1中A，B）。在病害调查的基础上，分离和选择保藏了3个色二孢菌株BMX-YF01，BMX-YF-02，BMX-YF03用于病原菌的鉴定。

A，B.白木香枝枯病症状；C.菌落形态；D.分生孢子形态；标尺 25 μm。

图1 可可毛色二孢危害白木香的症状及分生孢子形态学特征

Fig.1 Symptoms on Aquilaria sinensis caused by Lasiodiplodia theobromae and morphological characteristics of conidia

3.2 可可毛色二孢的培养性状 在25 ℃条件下，可可毛色二孢在PDA平板上生长极快，菌落直径扩展速率可达5 cm·L^-1，初期菌落为白色，第5天产生草绿色素，以后逐渐加深而成为黑褐色（图1中C）。气生菌丝发达，绒毛状。新生菌丝没有分隔，无色透明。老化的菌丝有分隔，多细胞，不规则分支。在pH 3.5的PDA平板上25 ℃培养2个月可形成子座，子座前期为灰黑色球形，直径4～5 mm，表面密生绒状菌丝丛，后期转成炭黑色圆柱形，直径3～4 mm，高度10～20 mm。分生孢子初无色，单胞，卵圆形，基部平截，端部钝圆，壁厚，表面光滑，成熟后变成茶褐色，中央有一隔膜，椭圆形，表面光滑，大小（14.8～16.5） μm × （20.2～27.6） μm。这些形态特征与可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Patouillard ） Griffon = Botryodiplodia theobromae Pat相符，该菌的有性型为葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina （Berkeley & Curtis） von Arx] ^[15]。

3.3 病原菌rDNA-ITS序列分析 用ITS1和ITS4引物，对3个枝枯病菌分离株rDNA的ITS区进行扩增，均产生1个大小约500 bp的DNA片段（图2）。序列比对结果显示，3个菌株的ITS1，ITS2和5.8 S的rDNA序列是一致的。通过BLAST搜索核酸数据库显示，枝枯病菌序列与Lasiodiplodia theobromae的ITS1，ITS2和5.8S rDNA序列（L. theobromae strain GrS1-2，Accession No. FJ904912.1）序列完全相同，相似性为100%。证实了分离自白木香的3个枝枯病菌菌株是可可毛色二孢L. theobromae，并注册于GenBank（登录号JQ782210）。从GenBank下载3个最相似物种L. theobromae （有性阶段B. rhodina），Diplodia seriata（有性阶段B. obtusa）和Fusicoccum aesculi（有性阶段B. dothidea）的ITS序列，用MEGA 4软件构建了系统发育树（图3）。白木香枝枯病菌BMX-YF菌株与B. rhodina 1个菌株（AY640255.1）及L. theobromae 2个菌株（GU066603.1和 HM466960.2）以bootstrap 99%的水平聚在一起（图3）。ITS序列分析结果，支持BMX-YF菌株与L. theobromae同属一种真菌。根据病原菌的形态特征、ITS序列相似性及系统发育树分析结果，确定白木香枝枯病菌属真菌界、子囊菌门Ascomycota、盘菌亚门Pezizomycotina、不确定的座囊菌纲Dothideomycetes incertae sedis、葡萄座腔菌目Botryosphaeriales、萄葡座腔菌科Botryosphaeriaceae、葡萄座腔菌属Botryosphaeria；无性阶段为毛色二孢属Lasiodiplodia、可可毛色二孢L. theobromae。

3.4 致病性试验 2009年8月，用3个枝枯病菌分离株分接白木香树，测定其致病性，结果显示发病率为100%，对照不发病。表现的症状与自然病株相似。病斑初为圆形，水渍状，黑褐色，后扩展成长条斑，稍凹陷，纵裂，深达木质部。病斑附近皮孔增粗，病部组织坏死，肿胀呈溃疡斑，枝叶凋萎枯死。

M.DL 2 000 DNA Marker；1～3.Lasiodiplodia theobromae strains of Baimuxiang-YF01，Baimuxiang-YF02，Baimuxiang-YF03；4.阴性对照（水作模板）。

图2 通用引物ITS1/ITS4对可可毛色二孢的PCR扩增

Fig.2 Amplification product of DNA from Lasiodiplodia theobromae using primers ITS1 and ITS4

图3 基于葡萄座腔菌属菌rDNA-ITS区域碱基序列构建的NJ系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method based on the sequences of the internal transcribed spacer （ITS）1-5.8S-ITS2 ribosomal DNA regions of Botryosphaeria spp. isolated

在病部产生明显的小黑粒，即病菌分生孢子器。再分离得到同样的病原菌。接种试验证实分离的3个枝枯菌株是白木香植物的病原菌。

3.5 接种部位的沉香物质鉴别 参照《中国药典》（2010年版）对接种可可毛色二孢1个月的白木香枝条进行显微鉴别和浸出物显色鉴别。显微鉴别结果显示，在接种的白木香树枝导管内均有不同数量的病菌菌丝体存在（图4中A），一些被菌丝体侵染的导管附近，观察到一些导管中有数量不等的导管填充物（图4中B）。导管填充物呈棕色，有的只在导管内壁上，有的则充满整个导管的腔体（图4中C）。在侵染部位附近的白木香射线细胞和内涵韧皮部薄壁细胞产生了棕色树脂。浸出物鉴别结果显示，浸出物为黄褐色油状物，香气浓郁，于油状物上加盐酸1滴与香草醛少量，再滴加乙醇1～2滴，渐显樱红色，放置后颜色加深，呈现典型的沉香显色反应（图4中D），这与《中国药典》（2010年版）沉香浸出物显色鉴别描述一致。接种无菌的PDA培养基块的白木香茎的浸出物无此现象。

A.真菌侵染次生木质部导管（标尺=10 μm）；B.真菌诱导白木香射线细胞、内涵韧皮部薄壁细胞和导管中产生了棕色树脂（标尺=50 μm）；C.植物导管填充物的扫描电镜观察（标尺=10 μm）；D.香草醛/盐酸法鉴别沉香类物质。

图4 可可毛色二孢侵染白木香次生木质部，诱导寄主植物产生导管填充物并积累沉香类物质

Fig.4 Lasiodiplodia theobromae infected the stem or branches of Aquilaria sinensis and induced the host plant to form vessel occlusions and produce agarwood materials

4 讨论

本研究发现的枝枯菌经鉴定其病原为可可毛色二孢L. theobromae，其主要特征是分生孢子初无色，单胞，卵圆形，基部平截，端部钝圆，壁厚，表面光滑，成熟后变成茶褐色，中央有一隔膜，椭圆形，表面光滑。进一步研究表明枝枯菌能够侵入白木香木质部激活其防御反应，诱导射线细胞和内涵韧皮部的薄壁细胞产生红棕色物质并在导管中形成填充物，积累形成沉香药材。据此，课题组对分离的可可毛色二孢进行PDA培养基活化，马铃薯蔗糖液体培养基发酵后接种于白木香基质，于25 ℃恒温、黑暗、通气条件下培养3～5 d后，成功制备了沉香真菌诱导剂。该法方法已经获得国家发明专利授权（ZL200910241212.8）。该诱导剂可能在快速诱导沉香形成方面具有应用价值。

根据以往报道及作者前期研究，项目组提出了“白木香防御反应结香假说”，该假说认为物理、化学伤害或真菌侵染均是作为伤害激发子诱导白木香薄壁细胞产生防御反应并生成具有抑菌活性的防御物质——沉香倍半萜（药材沉香的主要化学成分），这些防御物质与细胞其他组分复合形成导管填充物堵塞白木香木质部的导管，以抵御外界物理、化学伤害或真菌侵染对白木香的进一步损伤^[16]。国内对真菌侵染研究主要集中在黄绿墨耳菌Melanotus flavolivens对白木香的侵染，但是黄绿墨耳菌为担子菌，是一种几无致病性、通常营腐生生活的木材腐朽菌，白木香并非其自然寄主，黄绿墨耳菌在白木香树干上生长非常缓慢，导致人工接菌结香成功率不高。白木香枝枯病菌的分离鉴定为进一步利用病原菌诱导产生沉香以及白木香结香机制研究提供了可能模型。

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Identification of pathogen of Aquilaria sinensis dieback disease

ZHANG Zheng^{1， 2}， YANG Yun²， WEI Jian-he^{1， 2*}， CHEN Xu-yu²， MENG Hui²， WANG Meng-xi^{1， 3}

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

2.Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medicinal Sciences & Peking Union Medical College，Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine， Wanning 571533， China；

3.Drug Research Institute of Life Science and Environment Science， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China）

[Abstract] Objective： The research focused on identification the pathogen of Aquilaria sinensis dieback disease and confirmation the function of inducing agarwood formation by fungi. Method： The morphological observation， rDNA ITS sequence analyses， Koch′s postulates and pathogenicity test were used to identify the isolates. Result： The isolates of the causal agent was Lasiodiplodia theobromae， which induced the plant to produce highly valuable agarwood. Conclusion： The first report of dieback disease of Aquilaria sinensis caused by L. theobromae， and our research results laid a theoretical foundation for agarwood production by using fungus.

[Key words] Aquilaria sinensis dieback disease； Lasiodiplodia theobromae； agarwood

doi：10.4268/cjcmm20131113

[责任编辑 吕冬梅]