多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建

摘要[目的]探索多角体病毒的包装特性，构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+BactoBac表达系统。[方法] 通过酶切连接的方式，将4个元件片段：作为标记的绿色荧光基因EGFP，BmCPV自身的多角体蛋白基因，用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽， 插入到质粒FastBacDual 中，利用AcMNPV BactoBac系统，得到整合表达重组Bacmid：Acpolyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后，检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白（EGFP）和能在胞质形成多角体的重组病毒vBmBac（polyh+）EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达；从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体，观察到多角体能被激发出绿色荧光，进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法，同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。

关键词杆状病毒；多角体；异源包埋

中图分类号S182文献标识码

A文章编号0517-6611（2016）02-184-04

Abstract [Objective] To make clear the packing mechanism of the BmNPV polyhedra，a polyhedrinplus BactoBac expression system for application in silkworm was constructed.

[Method] On the basis of plasmid FastBacDual，four components were integrated，which were EGFP gene as resistant marker，H1 signal peptide，polyhedrin gene from BmCPV and a flexible linker peptide. After enzyme digestion and ligation，high copy recombinant expression vector pFastBac Dual/polyhEGFP was constructed. pFastBac Dual/polyhEGFP was linearized and Acpolyh/EGFP transferred into Sf9 cells. [Result] Using this new system， vBmBac（polyh+）EGFP was constructed that the foreign gene and polyhedrin were both expressed at higher level and large amount of polyhedra were formed.Fluorescent microscopic observation demonstrated that EGFP and polyhedrin were expressed simultaneously，and the EGFP expression and polyhedra formation occurred in most of the jointly infected cells.Analysis of the purified polyhedra from jointly infected Sf9 cells showed that the foreign proteins were present in the polyhedra. [Conclusion]The result provide a new inspiration for efficient preservation of active proteins and development of new biopesticide with toxin protein and new delivery vector system for vaccines.

Key words Baculovirus； Polyhedra； Heterogeneous embedding

昆虫杆状病毒在其生活史中存在2种结构和形态截然不同的病毒粒子，即芽生型病毒（budded virus，BV）和多角体型病毒（occlusionderived virus，ODV）。ODV病毒主要在感染晚期被大量包涵入多角体蛋白结晶[1]。2种表型的病毒在形态、蛋白质组成和病毒囊膜的来源上都有所不同，导致在感染组织特异性以及病毒入侵宿主细胞方式上的差异[2]。关于质型多角体病毒（BmCPV）中多角体蛋白与病毒粒子之间相互作用的研究已有较多报道，但其包装机制尚不清楚。有学者推测，多角体蛋白和病毒之间可能存在特殊的识别作用，使多角体对病毒粒子进行特异性的包埋[3]。目前在开发的杆状病毒作为表达载体时，将多角体蛋白基因删除，由外源目的基因替代，利用多角体强启动子带动外源基因的表达[4]，重组病毒不能形成多角体。Mori 等[5]利用改良的杆状病毒表达载体，在培养的昆虫细胞内进行 BmCPV 多角体蛋白基因的体外表达，结果表明，BmCPV 的多角体蛋白可以进行自我包装，在无其他病毒因子存在的情况下能够组装成多角体晶体结构。

研究发现，多角体不仅可以对异源病毒粒子进行包装，还可以对一些异源蛋白进行包埋[6]。对 CPV 多角体蛋白分子晶体结构的研究表明，质型多角体是由同源结合的多角体蛋白分子三聚体相互作用组装成的致密蛋白晶体结构[1]，具有抗干燥、抗高温的作用，以保护包埋其中的病毒粒子免受不良环境的破坏[7]。核型多角体病毒（BmNPV）能够将感染细胞内表达的绿色荧光蛋白（EGFP）包埋进多角体中，对包埋其中的EGFP起到抗干燥等保护作用[8]，并认为EGFP是随机进入多角体中，且进入多角体内部的EGFP量很少。因此，笔者在昆虫杆状病毒表达系统（BactoBac）的基础上，以多角体蛋白氨基端的 H1 α螺旋序列作为多角体蛋白识别信号序列，将这种信号序列和绿色荧光蛋白基因 gfp 融合，并与 BmCPV 多角体蛋白基因共表达，实现绿色荧光蛋白能够被包埋进多角体，为利用多角体固定外源蛋白提供技术平台。

1材料与方法

1.1材料及主要试剂

pFastBac Dual载体、大肠杆菌DH5α、DH10BacTM、Sf9昆虫细胞，由江西省科学院微生物研究所分子生物学实验室保存。Sf9 细胞用 Grace+10%胎牛血清（FBS），于 28 ℃培养；Grace 培养基、胎牛血清为GIBCO/BRL 公司产品；逆转录酶 MMLV、限制性内切酶购自 Fermentas 公司；高保真 DNA 聚合酶、dNTPs、DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA 连接酶、MiniBest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit、pMD18T simple vector 载体等购自TaKaRa公司；DNA转染试剂Cellfectin购自Invitrogen公司；Western blot所用EGFP抗体购自Bio Vision公司；蛋白质标准分子质量Marker、Xgal、IPTG 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2BmCPV polyh基因片段和EGFP基因的克隆

根据BmCPV 基因组polyh序列 （ GenBank 登录号：GQ924589 ）及BactoBac表达系统供体质粒pFastBacHTB中多克隆位点序列设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

以江西省科学院微生物研究所分子生物学实验室构建并保存的pGEMT easy/EGFP质粒（带有H1信号肽、柔性连接肽和EGFP的序列）为模板，用EGFPF/EGFPR引物扩增EGFP基因序列片段。PCR产物（EGFP）与pMD18T simple vector连接反应按照说明书进行。重组质粒的转化、质粒的抽提等基因操作参照文献[37]进行。经 BamH Ⅰ和 Hind III 酶切鉴定含有外源片段的重组质粒pMD18T EGFP，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

以 BmCPV 中提取的 dsRNA 片段为模板，进行反转录合成 cDNA 第 1 链。以 CPV1和CPV2为引物，进行 PCR扩增多角体蛋白基因polhy。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后克隆进pMD18T simple vector 载体获得重组质粒 pMD18Tpolyh。

1.3重组转座载体与Bacmid穿梭载体的构建

将凝胶回收的polyh基因和pFastBac Dual质粒经过BamH I和Hind III双酶切后分别回收，polyh基因定向克隆于FastBacDual的PH启动子下游，构建的重组转移载体pFastBac Dualpolyh转化至DH5α，进行PCR和酶切鉴定。

将上述pFastBac Dualpolyh质粒和带H1信号肽的EGFP基因的PCR产物经Smal I和Kpn I双酶切后分别回收，并将带H1信号肽的EGFP基因定向克隆至pFastBac Dualpolyh的P10启动子下游，获得重组转移载体pFastBac DualpolyhEGFP，最后转化至DH5α，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

利用AcMNPV BactoBac系统，根据产品说明书构建重组Bacmid （Invitrogen公司）：分别将pFastBac Dual/polyhEGFP和对照质粒pFastBac Dual转化E.coli DH10BacTM感受态细胞，菌液涂于含有XGal（40 μg/mL）、IPTG （24 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、庆大霉素（100 μg/mL）和四环素（30 μg/mL）的培养基平板上，经蓝白斑筛选，48 h左右挑取白色菌落重新划线，待长出白色菌落后接种于含相应抗生素的LB培养基中，提取重组Bacmid DNA，用M13引物（M13F和M13R）PCR鉴定正确后，得到重组Bacmid：Acpolyh/EGFP。

1.4重组病毒的构建

Acpolyh/EGFP Bacmid DNA利用脂质体转染Sf9细胞，具体操作过程参照Cellfectin转染试剂说明书。以绿色荧光和多角体的出现判断重组病毒的产生，出现病变后收集上清进行二次感染，获得相应的重组病毒。用预冷的PBS清洗细胞数次，收集细胞。

1.5多角体的纯化及包埋蛋白分析

收集感染细胞，用30 mL PBS悬浮后超声波破碎，15 000 r/min离心收集多角体。将Percoll与PBS按9∶1（V/V）混合，调pH至7.2，12 000 r/min离心20 min，收集纯净的多角体。最后将纯化的多角体悬浮于含0.1% SDS的0.01 mmol/L PBS缓冲液中，室温放置5 min，然后用PBS洗涤2次得到最终纯化的多角体。

将纯化后的多角体进行12% SDSPAGE分析，再将蛋白转移到PVDF膜，进行Western blot检测。使用的一抗为兔抗EGFP多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，最后使用TMB显色。

2结果与分析

2.1重组转移载体pFastBac DualpolyheGFP的构建

BmCPV片段polhy dsRNA反转录后克隆进pMD18T，获得重组质粒pMD18Tpolhy，测序比对结果证实克隆片段为多角体蛋白基因（polhy）。pMD18Tpolh 经BamH I和Hind III双酶切后，克隆进经同样酶切的pFastBac Dual载体获得重组质粒 pFastBac Dualpolyh。以pGEMT easy/EGFP质粒为模板，用EGFPF/EGFPB引物扩增带H1信号肽的EGFP基因片段，克隆入供体质粒pFastBac Dualpolyh的P10启动子下游，获得重组转移载体pFastBac DualpolyhEGFP。

2.2重组病毒的构建和多角体的形成

以 pFastBac DualpolyhEGFP质粒转化AcMNPV BactoBac系统的E.coli DH10BacTM感受态细胞，得到同时表达polyh和EGFP基因的重组Bacmid：Acpolyh/EGFP。Acpolyh/EGFP用M13F和 M13R 引物进行PCR鉴定和测序比对分析，结果表明外源基因片段插入至正确位置。将Bacmid DNA转染Sf9 细胞，发现所有感染的细胞内都能观察到大量的多角体，且发射出很强的绿色荧光（图1）。从感染细胞中分离纯化多角体，于荧光显微镜下观察发现多角体能发射绿色荧光（图2）。通过SDSPAGE分析可见有29.0 ku左右的绿色荧光蛋白和31.0 ku左右的多角体蛋白同时得到表达，说明重组病毒构建正确（图3A）。

2.3多角体中包埋融合蛋白的分析

为了进一步验证绿色荧光蛋白存在于多角体内部，对纯化后的多角体进行SDSPAGE和Western blot分析，结果表明，纯化后的多角体中有29.0 ku左右的绿色荧光蛋白条带能被绿色荧光蛋白的抗体所识别（图3B、C）。表明绿色荧光蛋白与多角体蛋白可以同时表达，且绿色荧光蛋白都被包埋进入多角体中。这说明该研究构建的新系统不仅能够形成多角体，外源基因也能够得到较高水平的表达。

3结论与讨论

该研究构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白且可以形成多角体的重组病毒vAcpolyh/EGFP，当该重组病毒感染Sf9细胞时，发现绿色荧光蛋白与多角体蛋白可以在同一个细胞中同时表达，且所形成的病毒多角体中带有一定量的绿色荧光蛋白。

Ikeda等[9]和 Ijiri等[10]先后通过试验证明了 BmCPV 病毒核衣壳蛋白 VP3 的 N末端42 ～ 93 区域的 52 个氨基酸残基和 CPV 多角体蛋白氨基端的 H1α螺旋序列可作为多角体蛋白识别信号序列，将这种信号序列同外源蛋白基因融合，当与多角体蛋白基因共表达时，外源融合蛋白能够被包埋进多角体。曹翠平等[3]将不同截短的多角体蛋白基因与 EGFP 基因融合表达，结果以多角体蛋白 N 末端 100 个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定 EGFP 的效率最高。将EGFP基因、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt） 毒素基因与多角体蛋白基因按顺序融合，构建了可以同时表达多角体蛋白和融合蛋白的重组杆状病毒，证实多角体既可以包埋杆状病毒粒子[11]，又可以对 Bt 毒素和EGFP 进行包埋。

关于多角体包裹目的蛋白的技术手段多是通过构建2个重组杆状病毒，即一个专一表达质型多角体病毒多角体蛋白（包裹蛋白）的杆状病毒，另一个专一表达目的蛋白的杆状病毒，通过调节2种病毒的比例混合感染Sf9昆虫细胞，再从细胞中分离出多角体[3，6，11]。该方法不适合从昆虫细胞中收集大量的多角体，由于很多细胞在混合感染时只感染了一种病毒，所以会形成较多空多角体，以致于包裹效率低。该研究利用杆状病毒表达系统，同时将质型多角体蛋白基因和目的蛋白基因分别构建到pFastBacTMDual载体的PH与P10启动子下，并在绿色荧光蛋白与信号肽之间引入柔性链接肽，通过与病毒骨架重组，获得重组杆状病毒。通过该单一病毒感染Sf9昆虫细胞，直接可以在细胞内产生所需要的包裹型蛋白，且这种重组型病毒也同样可以获得扩增。相对于国外通过2种病毒按照比例进行混合感染相比[8-9]，该研究工艺简单，产生的包裹型蛋白效率更高，另外在产生包裹型蛋白的同时重组病毒粒子也获得了扩增，更适合通过昆虫细胞发酵大规模制备多角体包裹型蛋白。多角体形成的分子机制不仅能够更全面地解释杆状病毒的生物学特性，并能有效地解决蛋白质不稳定和难于长期保存的问题，有望在固定毒素蛋白、开发新型生物杀虫剂以及开发基因治疗新型载体和新型纳米技术等领域发挥重要作用。

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