诺如病毒检测技术研究

摘 要：诺如病毒是非细菌性腹泻暴发的主要病原之一，对相关检测技术的研究十分必要。本文通过引物、探针、染料的选择，结合适用范围、灵敏度、特异性、重复性的评估对常规反转录-聚合酶链反应、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增、基因芯片、酶联免疫吸附测定和荧光微球检测条快速检测诺如病毒的技术进行了综述。着重关注了食品和水中诺如病毒检测的病毒富集技术，并提出平衡准确灵敏与简便高效对诺如病毒检测技术的研究具有重要意义。

关键词：诺如病毒；聚合酶链反应；荧光定量；反转录；RT-PCR；RT-LAMP

中图分类号：R373.2+5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.18

文章编号：1006-1959（2018）02-0051-03

Abstract：Norovirus is one of the main pathogens in non bacterial diarrhea，research on correlation detection technology is very necessary.This paper probes，primers，dye selection，combined with the applicable scope，sensitivity，specificity，repeatability of the evaluation of conventional reverse transcription polymerase chain reaction，fluorescence quantitative reverse transcription loop mediated RT-PCR.Mediated isothermal amplification，gene chip，ELISA and fluorescent microsphere detection strip for rapid detection of norovirus technology are reviewed.Focusing on the technology of virus detection in food and water eichment of norovirus，and put forward the balance is accurate and sensitive and efficient research on the detection of norovirus has important significance.

Key words：Norovirus；Polymerase chain reaction；Fluorescence quantitation；Reverse transcription；RT-PCR；RT-LAMP

諾如病毒（norovirus）引起的急性肠胃炎在我国成上升趋势，尤其在学校、幼儿园、养老院等低抵抗力人群聚集地易引起集体暴发。诺如病毒传染性很强，可经粪-口传播、人传人、可经受病毒污染的水、食品等传播。据估计，由诺如病毒造成的非细菌性腹泻暴发占总数的50%～80%左右[1]。近年来，诺如病毒检测方法的相关研究快速发展，对诺如病毒的准确检测为其流行病学分析提供了依据，是有效防控该病毒的基础。

1 病毒分型

诺如病毒依据其基因RNA聚合酶和主要衣壳蛋白VP1的核苷酸序列的同源性，可分为5个基因组：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ，其中易感染人的主要是GⅠ和GⅡ基因组，国内尤以 GⅡ为多。而基于VP1基因组序列的相似性以>85%为界，可进一步将基因组分为不同的基因型：GⅠ-8个型，GⅡ-21个型，GⅢ-3个型，GⅣ-2个型，GⅤ-1个型[2]。

2 检测技术的研究进展

目前诺如病毒的检测技术主要有反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）、基因芯片、酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光微球检测条快速检测。

2.1 常规反转录-聚合酶链反应 反转录RT技术是将RNA为模板，以反转录酶催化，用引物合成互补DNA，再经PCR采用特异性引物扩增[3]，是定性检测诺如病毒的经典技术。

王作虪等[4]用RT-PCR对131份腹泻儿童的粪便标准进行检测，使用两对引物：① JV12：5"ATACCACTATGATGCAGATTA 3"/SM31：5"CGATTTCATCATCACCATA 3"，扩增目标长度为432bp；②4581： 5"TCTTCTCCTTCTATGGTGATGATGA3"/5102：5"CTTAGACGCCATCTTCATTTACG 3"，扩增目标长度为522bp，通过振荡离心过滤后从粪便标本中提取出病毒RNA，经引物反转录后PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶检测特异性片段，结果131份粪便标本中检出诺如病毒阳性22份，阳性标本经和已知核苷酸序列比对鉴定出22份标准均为GⅡ4型。

2.2荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR技术是在RT-PCR技术的基础上利用染料或探针监测PCR反应管中的荧光信号从而达到定量的目的，目前实时荧光定量RT-PCR已逐渐替代常规RT-PCR成为应用最为广泛的定量定性检测诺如病毒的技术。

陈传德等[5]选择了两种不同型号的荧光定量PCR仪，分别制作绝对定量标准曲线，以OG 1F/COG 1R、COG 2F/COG 2R为引物，以Taqman探针监测荧光信号，建立了有良好灵敏度、重复性的荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的技术，并通过试验了轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒等易引起干扰的病毒，得出该方法具有良好的特异性。刘巍等[6]比较了荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR、酶联免疫法ELISA，对34个粪便样本阳性检出率分别为85.3%、76.5%、26.5%，可见荧光定量RT-PCR技术对诺如病毒的检测灵敏度较高。王毅谦等[7]用双重荧光RT-PCR的方法检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，该研究使用allglo探针，对GⅠ和GⅡ型诺如病毒的检出限为10copies/μl，比Taqman探针法和单重荧光RT-PCR法更加灵敏，该研究设计的引物和allglo探针，标记不同的荧光报告集团MAR和JUP，可于同一反应管内同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，提高了检测效率。莫雪梅等[8]用SYBR GreenⅠ荧光染料RT-PCR法检测了贝类中的GⅡ型诺如病毒，检测下限为100copies，检测的稳定性较好，研究证明SYBR GreenⅠ荧光染料的浓度是影响结果的关键因素，浓度过低造成荧光强度小灵敏度不够，浓度过高会抑制PCR反应，SYBR GreenⅠ荧光染料的终浓度为1×是合适的，此外该研究还将退火温度提高到52 ℃以消减引物二聚体引起的干扰，达到了良好的效果。

2.3病毒的富集 在检测食品与水中诺如病毒时，由于病毒含量小，此时病毒的富集成为了最关键的环节，如膜过滤法和有机絮凝沉淀法[9]等富集手段。在采样后，食品样品的处理主要有两个步骤：先对样本基质上诺如病毒的洗脱和浓缩，然后提取诺如病毒的核酸，其中由以从样本基质上洗脱和浓缩诺如病毒最为关键[10]。邓丽丽等[11]在用荧光定量RT-PCR技术检测牡蛎中诺如病毒时，着重摸索前处理方法，即病毒的富集，他们通过化甘氨酸缓冲液处理牡蛎匀浆液，摸索聚乙二醇（PEG）沉淀浓缩病毒的浓度，得到甘氨酸缓冲液pH值为4.5，PEG沉淀浓度为16%时的诺如病毒富集提取效果最好。周晓红等[12]评估了用混合硝酸纤维素膜（MCE）和PEG沉淀共二次富集的方法检测水中诺如病毒的方法，证明该方法将水样浓缩了1000倍，大大提高了灵敏度，可用于水体中诺如病毒的检测。李楠等[13]比较了磁珠富集法和PEG沉淀法检测草莓中GⅡ型诺如病毒的适用性，结果显示磁珠富集法的回收率略高于PEG沉淀法的回收率，而且两种方法的回收率结果均能满足检测要求，均适用于检测草莓中的GⅡ型诺如病毒，该研究也给其他的食品类样本的病毒富集提供了一定的參考。张其刚等[14]比较猪胃黏蛋白偶联磁珠和PEG8000富集检测了青葱和葡萄中的诺如病毒，结果显示对青葱来说，高接种量下两种富集方法回收率差不多，低接种量下猪胃黏蛋白偶联磁珠法的回收率高于PEG8000，而对于葡萄来说，猪胃黏蛋白偶联磁珠法高低接种量的回收率均高于PEG8000，显示PGM-MB法富集效果要好于PEG8000，这与研究[13]的结果是吻合的。徐奋奋等[15]将不同浓度的GⅡ型诺如病毒加入水中，用钙离子法富集，研究结果显示钙离子富集法对水中GⅡ型诺如病毒的检测回收率可以达到81.6%，检测灵敏度达到10copies/μL，均较好，且具备快速简便的优点，适用于基层实验室进行水中GⅡ型诺如病毒的快速检测。

2.4反转录-环介导等温扩增 罗剑鸣等[16]建立了一种基于颜色判定的GⅡ型诺如病毒的RT-LAMP检测技术，通过扩增前加入羟基萘酚蓝染料，以颜色变化判断结果，结论显示此方法与常规RT-PCR相比灵敏度相当，检测效率更高，可用于GⅡ型诺如病毒的现场快速检测。

2.5基因芯片 史蕾等[17]用链霉亲和素包被的磁珠作标记物，以生物素标记的核算为样本，通过它们的亲和作用，进行核算杂交检测，建立了基于磁珠的可视化基因芯片检测诺如病毒，结论显示该方法灵敏度、特异性、重复性均较好，且具有快速、直观的优点。

2.6酶联免疫吸附测定 温来欣等[18]建立了异硫氰算荧光素（FITC）-抗FITC放大系统的检测人粪便中诺如病毒抗原的ELISA法，通过与商业化酶联免疫法试剂盒比对，得出该方法灵敏度、特异性均较好，且具有成本低的优点。

3 总结

依据诺如病毒的污染途径，粪便、食品、水成为了诺如病毒检测的主要样本，粪便的检测技术的研究相对更成熟，对于食品和水来说，怎样合理有效的将病毒富集，避免过程的损失成为检测灵敏度是否满足要求的决定性环节，故食品和水中诺如病毒检测的相关研究聚焦于病毒的富集技术是必要的。

诺如病毒的检测技术发展至今，实时荧光定量RT-PCR技术因其具备可靠的灵敏度、特异性等优势已经成为应用最为广泛的检测技术，同时为了适应疫情暴发的及时处置，一些更加适合现场快速检测的试剂条、试剂盒等技术也正在快速发展。对研究者来说，怎样处理好准确灵敏与简便高效这二者之间的平衡对诺如病毒检测技术的发展具有重要意义。

参考文献：

[1]徐友富，童贻刚，茹志涛，等.诺如病毒感染国内外研究概况[J].中国卫生检验杂志，2008，18（5）：949-951.

[2]Division of Viral Diseases，National Center for Immunization and Respiratory Diseases，Centers for Disease Control and Prevention.Updated norovirus outbreak management and disease prevention guidelines[J].MMWR Recomm Rep，2011，60（RR-3）：1-18.

[3]李志凯，苏国成，苏文金.等.诺如病毒检测方法研究进展[J].微生物学通报，2014，41（7）：1417-1424.

[4]王作虪，韩悦，安淑一，等.诺如病毒RT-PCR检测及进化树分析[J].中国卫生检验杂志，2008，18（5）：783-785.

[5]陈传德，周晓红，莫艳玲，等.荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价[J].中国卫生检验杂志，2010（3）：467-469.

[6]刘巍，隆文杰，石玲玲，等.应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒[J]. 应用预防医学，2007，13（3）：129-132.

[7]王毅谦，石晶，吴福平，等. GI和GII型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测[J].中国公共卫生，2013，29（4）：599-602.

[8]莫雪梅，高东微.SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒[J].生物工程学报，2010，26（6）：817-822.

[9]周晓红，李晖，杨杏芬.食品中诺如病毒RT-PCR检测技术研究进展[J].环境卫生学杂志，2009（4）：234-238.

[10]谢雅晶，刘贤金.食源性诺如病毒在果蔬农产品中的污染及检测研究[J].病毒学报，2015（6）：685-697.

[11]邓丽丽，刘巍，莫建光，等.应用荧光定量RT-PCR法检测牡蛎中诺如病毒[J].中国热带医学，2011，11（2）：133-135.

[12]周晓红，李晖，杨杏芬，等.水中诺如病毒富集及定量检测研究[J].热带医学杂志，2010，10（2）：137-140.

[13]李楠，王佳慧，李凤琴，等.检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较[J].中国食品卫生杂志，2015，27（3）：242-246.

[14]张其刚，潘良文，李想，等.猪胃黏蛋白偶联磁珠和聚乙二醇富集检测青葱和葡萄中诺如病毒的比较研究[J].食品科学，2012（16）：241-245.

[15]徐奋奋，蔡颖，黄亚琴，等.水中诺如病毒浓缩与应急检测研究[J].中国卫生检验杂志，2015（7）：977-979.

[16]罗剑鸣，吴希阳，徐子乾，等.基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增技术检测GII型诺如病毒基因[J].病毒学报，2012，28（2）：165-171.

[17]史蕾，顾大勇，徐云庆，等.基于磁珠的可视化基因芯片在诺如病毒快速检测中的应用[J]. 中国热带医学，2009，9（4）：596-598.

[18]温来欣，司萍，杨东平，等.诺如病毒抗原的异硫氰酸荧光素标记-酶联免疫吸附检测法[J].环境与健康杂志，2015，32（3）：252-255.

收稿日期：2017-7-8；修回日期：2017-8-12

编辑/成森