外周血中钙调蛋白对阿尔茨海默病的诊断价值

打开文本图片集

[摘要] 目的 检测阿尔茨海默病（AD）患者外周血单个核细胞和血浆中钙调蛋白（CaM）的表达水平，评价其作为AD生物标志物的诊断价值。 方法 将2013年2月～2015年1月于青岛大学医学院附属海慈医院就诊和体检的对象共116例纳入本研究，包括AD患者40例、轻度认知障碍（MCI）患者20例、帕金森病（PD）患者20例、额颞叶痴呆（FTD）患者10例、路易体痴呆（DLB）患者10例、进行性核上性麻痹（PSP）患者6例、认知正常的健康体检者（对照组）10名。取外周血分离单个核细胞和血浆，采用Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测CaM在外周血单个核细胞和血浆中的表达水平，并通过绘制ROC曲线判断其诊断能力。 结果 AD患者外周血单个核细胞和血浆中CaM的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），且CaM的表达水平不随AD的进展变化。以对照组和PSP、DLB、FTD、PD患者中CaM的表达作为标准绘制ROC曲线，曲线下面积分别为0.958、0.946、0.846、0.958和0.896。 结论 CaM在AD患者外周血单个核细胞和血浆中高表达，是一种潜在的AD生物标志物。

[关键词] 阿尔茨海默病；钙调蛋白；外周血；生物标志物；诊断价值

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（b）-0050-04

[Abstract] Objective To test the expression levels of calmodulin （CaM） in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with Alzheimer disease （AD）， and to evaluate its diagnostic value as the biomarker of AD. Methods Total 116 objects treated and examined in the Affiliated Hiser Hospital of Qingdao University Medical College from February 2013 to January 2015 were eolled into the research， including 40 cases with AD， 20 cases with mild cognitive impairment （MCI）， 20 cases with Parkinson disease （PD）， 10 cases with frontotemporal dementia （FTD）， 10 cases with dementia with Lewy bodies （DLB）， 6 cases with progressive supranuclear palsy （PSP） and 10 healthy cases with normal cognition （control group）. The peripheral blood was obtained to separate the mononuclear cells and plasma. Western blot and enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA） were used to test the levels of CaM in mononuclear cells and plasma of peripheral blood respectively， and receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn to estimate the diagnostic value of CaM. Results Compared with the control group， the levels of CaM in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with AD were significantly higher than those of control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）， and the expression level of CaM did not change with the progress of AD. The expression of CaM in control group and PSP， DLB， FTD， PD patients was as standard to draw ROC curve， the area under the ROC curve was 0.958， 0.946， 0.846， 0.958 and 0.896 respectively. Conclusion CaM is highly expressed in the mononuclear cells and plasma of peripheral blood of patients with AD， which is a potential biomarker of AD.

[Key words] Alzheimer disease； Calmodulin； Peripheral blood； Biomarker； Diagnostic value

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，患者大脑内形成淀粉样蛋白斑，乙酰胆碱能神经元大量死亡[1-2]。一系列临床研究和尸检报道显示，AD的病理学改变往往在发病早期已经出现，但目前AD的诊断耗时较长，需要进行一系列的临床诊断、心理学测试及影像学检测，且需要排除其他神经系统性疾病[3-4]。目前现有的生物标志物存在取样困难、特异性低等缺点[5-6]。Solomon等[7]通过免疫组化染色发现钙调蛋白（calmodulin，CaM）在死亡的AD患者脑组织中表达较低，但其是否在AD患者外周血中存在表达异常目前并不清楚。本研究通过比较AD患者和其他几种痴呆患者血液中CaM的表达水平，评价CaM作为AD生物标志物的潜能，为AD的临床治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年2月～2015年1月于青岛大学医学院附属海慈医院就诊和查体的AD患者40例（符合美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病学会诊断标准），并根据患者疾病的进展情况分为轻度20例、中度12例和重度8例，轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）患者20例[符合Petersen的诊断标准，临床痴呆程度评定量表（CDR）评分等于0.5]，帕金森病（Parkinson disease，PD）患者20例（符合1984年全国锥体外系疾病讨论会关于《帕金森病及帕金森综合征的诊断标准和鉴别诊断》），额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）患者10例（符合1998年额颞叶痴呆诊断标准），路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）患者10例（符合2005年修订的DLB统一诊断标准），进行性核上性麻痹患者（progressive supranuclear palsy，PSP）6例（符合NINDS-SPSP标准），认知正常的健康体检者10名（对照组）。排除有认知障碍家族史、头颅外伤史的患者。本研究经过医院伦理委员会批准，研究对象知情并同意。研究对象的一般资料经分析比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

对各个研究对象进行常规取血，一部分血液经过离心分离血浆，另一部分用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。分离出的淋巴细胞经磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后用含10% 胎牛血清（FBS）的1640培养基按照2×106个/mL的浓度接种于培养皿中，37℃，5% CO2培养48 h。收集淋巴细胞，PBS清洗后加入TritonX-100裂解缓冲液充分裂解细胞，BCA试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）测定蛋白质浓度。对蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用脱脂奶粉封闭，加入小鼠抗人钙调蛋白抗体（1∶1500，购自艾美捷科技有限公司）和抗β-actin抗体（1∶1500，购自艾美捷科技有限公司）4℃过夜后，加入辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠IgG二抗（碧云天）室温孵育1 h，化学发光法检测，Image J检测蛋白条带密度。血浆中CaM的水平用人钙调蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（购自上海士锋生物科技有限公司）测定。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0软件分析实验中得到的数据，计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，组间比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CaM在外周血单个核细胞中的表达水平

各组研究对象单个核细胞中CaM的表达水平如图1～2所示。与对照组比较，AD患者外周血中CaM的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。PSP、FTD、PD患者单个核细胞中CaM的表达水平略高于对照组，DLB患者略低于对照组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 CaM在外周血血浆中的表达水平

CaM在不同研究对象血浆中的表达趋势与单个核细胞中的表达相似，AD患者的表达水平显著高于对照组（P < 0.05）；PSP、DLB、FTD和PD患者血浆中的表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.3 CaM在不同严重程度疾病中的表达水平

CaM在对照组、MCI患者和不同严重程度AD患者中的表达水平如图4～5所示。经统计学分析，MCI患者的表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），不同严重程度AD患者的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。但是，轻、中度AD和重度AD之间的CaM表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 CaM在不同患者中诊断AD的效能比较

ROC曲线绘制结果显示，CaM作为生物标志物在对照组、PSP、DLB、FTD、PD患者中诊断AD的曲线下面积分别为0.958、0.946、0.846、0.958和0.896，具有较高的诊断价值。根据SPSS软件所给出各点敏感性和1-特异性的值找出敏感性+特异性-1最大值的点作为截点，该点的敏感性和特异性即为该曲线敏感性特异性值，具体见表2。

3 讨论

AD的发病机制目前并不清楚，目前存在多种假说[8-9]。而不论在钙离子失衡假说还是淀粉体假说中，CaM均发挥了至关重要的作用[10]。现已证明，CaM对多种神经活动起着重要的调控作用，其与多种蛋白配合，可调控突触神经递质的释放和突触的多种电生理活动[11-12]。目前，虽然CaM在AD发病中发挥的作用并不完全清楚，但是大量临床研究和动物实验均表明AD患者海马区及外周血中CaM和钙调蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent proteinkinase Ⅱ，CaMKⅡ）表达存在异常，可能是一种潜在的AD生物标志物[13-14]。Esteras等[15]报道，AD患者外周血单个核细胞中的CaMKⅡ较正常细胞表达上升，CaMKⅡ是CaM的下游效应蛋白，这可能预示着AD患者外周血细胞中CaM的异常表达。本研究通过检测AD患者外周血单个核细胞和血浆中CaM的表达水平，探讨其作为AD生物标志物的潜在价值。

本研究结果显示，AD患者外周血单个核细胞中CaM的表达水平显著高于对照组和PSP、DLB、FTD、PD患者。通过绘制ROC曲线，可见对照组及其他痴呆患者的曲线下面积均大于0.75，表明CaM作为生物标志物诊断AD的准确性较高。笔者又检测了各研究对象血浆中CaM的表达，结果显示其表达呈现出与单个核细胞类似的变化趋势，这可能为AD的诊断提供了一种更为便捷的方法。研究表明，CaM和钙调蛋白激酶家族在包括G1/S、G2/M等多个细胞周期检查点中发挥了重要的调节作用[16]。很多细胞周期蛋白中存在CaM结合位点，且有丝分裂可以刺激Ca2+-CaM介导的细胞反应，导致细胞对Ca2+敏感性和CaM在亚细胞结构中的分布发生变化，最终导致CaM和CaM结合位点相互作用异常，Ca2+稳态失衡[17]。同时，葡萄糖代谢降低、β淀粉样蛋白的产生、炎性反应等也可导致神经细胞内Ca2+稳态的改变[18]。细胞内Ca2+超载则进一步促进细胞凋亡。

综上所述，CaM在AD患者的外周血单个核细胞和血浆中均高表达，具有较高的诊断价值，是一种潜在的AD生物标志物。但是本研究也存在一定的缺陷，如样本量较小，且纳入的其他痴呆性疾病并不全面，这些都需要在以后的工作中进一步完善。

[参考文献]

[1] Koen JD，Yonelinas AP. The effects of healthy aging，amnestic mild cognitive impairment，and Alzheimer"s disease on recollection and familiarity：a meta-analytic review [J]. Neuropsychol Review，2014，24（3）：332-354.

[2] 王树英，秦伟，贾建平.阿尔茨海默病认知损害的研究进展[J].中华老年医学杂志，2014，33（6）：682-684.

[3] Naylor MD，Karlawish JH，Arnold SE，et al. Advancing Alzheimer"s disease diagnosis，treatment，and care：recommendations from the Ware Invitational Summit [J]. Alzhe-imer"s & Dementia，2012，8（5）：445-452.

[4] Dubois B，Feldman HH，Jacova C，et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer"s disease：the IWG-2 criteria [J]. Lancet Neurol，2014，13（6）：614-629.

[5] Bateman RJ，Xiong C，Benzinger TL，et al. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer"s disease [J]. N Engl J Med，2012，367（9）：795-804.

[6] Berridge MJ. Calcium regulation of neural rhythms，memory and Alzheimer"s disease [J]. J Physiol，2014，592（Pt2）：281-293.

[7] Solomon B，Koppel R，Jossiphov J. Immunostaining of calmodulin and aluminium in Alzheimer"s disease-affected brains [J]. Brain Res Bull，2001，55（2）：253-256.

[8] Morgen K，Frlich L. The metabolism hypothesis of Alzh-eimer"s disease：from the concept of central insulin resistance and associated consequences to insulin therapy [J]. J Neural Transm，2015，122（4）：499-504.

[9] 朱奕潼，苗雅，钟远.阿尔茨海默病的蛋白质组学研究进展[J].中华老年医学杂志，2015，34（1）：106-108.

[10] O"Day DH，Eshak K，Myre MA. Calmodulin binding proteins and Alzheimer"s disease [J]. J Alzheimers Dis，2015， 46（3）：553-569.

[11] Swarnkar S，Goswami P，Kamat PK，et al. Rotenone-induced apoptosis and role of calcium：a study on Neuro-2a cells [J]. Arch Toxicol，2012，86（9）：1387-1397.

[12] 倪炜，王正朝，黄晓红.钙调蛋白及其结合蛋白对神经递质释放的调控作用[J].中国生物化学与分子生物学报，2013，29（4）：316-324.

[13] Min D，Guo F，Zhu S，et al. The alterations of Ca2+/calmodulin/CaMKⅡ/Ca V 1.2 signaling in experimental models of Alzheimer"s disease and vascular dementia [J]. Neurosci Lett，2013，538：60-65.

[14] Wang S，Liu M，Zhang Z，et al. EGCG and nimodipine improve the symptoms of AD by inhibiting [Ca2+] in hippocampal neurons of APP/PS1 transgenic mice [J]. Molecular Neurodegeneration，2012，7（Suppl 1）：S30.

[15] Esteras N，Munoz U，Alquézar C，et al. Altered calmodulin degradation and signaling in non-neuronal cells from Alzheimer"s disease patients [J]. Curr Alzheimer Res，2012， 9（3）：267-277.

[16] 李晓晴，王力，冯立群，等.阿尔茨海默病的发病机制和细胞周期假说[J].中华神经医学杂志，2011，10（7）：752-754.

[17] Seward ME，Swanson E，Norambuena A，et al. Amyloid-β signals through tau to drive ectopic neuronal cell cycle re-entry in Alzheimer"s disease [J]. J Cell Sci，2013，126（5）：1278-1286.

[18] Demuro A，Smith M，Parker I. Single-channel Ca2+ imaging implicates Aβ1-42 amyloid pores in Alzheimer"s disease pathology [J]. J Cell Biol，2011，195（3）：515-524.

（收稿日期：2015-10-09 本文编辑：张瑜杰）